леток или нервной клетки и мышечной клетки (так называемого синапса) для передачи электрического (нервного) импульса от одной клетки к другой. Такое химическое соединение служит для передачи электрического разряда между двумя клетками, поскольку нейромедиатор выделяется лишь после того, как электрический импульс достигает синапса, и, как только нейромедиатор связывается со второй клеткой, возникает разность потенциалов,

Р * Последние исследования показали, что такое описание слишком упрощенно [34]. сАМР-зависимая протеинкиназа представляет собой тстрамерный белок R2C2, состоящий нз двух каталитических и двух регуляторных субъединнц. Далее, сЛМР-завнспмые протеинкиназы можно разделить на два типа: I и II. Основное различие между двумя этими типами заключается в способности регуляторных субъединнц киназ типа II фосфорилироваться каталитической субъединицей. В то же время cGMP-зависнмая протеинкиназа представляет собой димерный белок, состоящий из двух идентичных субъединнц. Каждая субъеднница йчеет rGTP-связывающий и каталитический цеитры в одной полипептндной цепи.

144

Глава 3

которая приводит к возниковснию электрическою импульса во второй клетке. Интересно, что возникновение такого потенциала действия в определенной нервной клетке, видимо, требует присутствия протеинкиназы, зависимой от циклического нуклеотида.

(сАМР)

« ноч

/F>v /coo%J3~-JQ соое

H°4UbCH^CHxe —5Г— но-^0/-сн'сн\* У^=У xnh3 xnh3

тирозин ДОФА

сенарбоксилаэа. _со» НО\_v 9Н Зофамин-р-Ыро- НОч

ho-cr^-chch2nh3 «- hohTj>-ch2ch2nh3

норэпинефрин йофамин

сАМР активирует также фермент РНК-полнмеразу I (млекопитающих) при помощи обычного фосфорилирования, осуществляемого протеинкиназой. Этот фермент катализирует синтез полимера мРНК — процесс, необходимый в синтезе белков определенной аминокислотной последовательности. В число других ферментов, активность которых регулируется циклическими иук-леотидами, входят глнкогененнтетаза (синтез гликогена), фос-фофруктокиназа (фосфорилирование фруктозо-6-фосфата), орнн-тиндекарбокенлаза (декарбоксилнрованне аминокислоты орннтн-на) и АТРаза (гидролиз АТР).

Следует отметить, что цнклофосфатное кольцо в сАМР и cGMP — высокоэнергетическая структура [35]. При рН 7,3 АОгидр этих соединений приблизительно на —12,5 кДж/моль (—3,0 ккал/моль) больше, чем для АТР, который является формой хранения биологической энергии. Такое значение свободной энергии объясняется главным образом вкладом энтальпии, АЯщдр, которая для сАМР н cGTP составляет —59,2(—14,1) и —44,1 кДж/моль (—10,5 ккал/моль) соответственно. В результате гидролиза, конечно же, происходит превращение циклического нуклеотида в 5'-ациклическую структуру:

основание о основание

Н20:~^0-у°\/ + НОх|/°-Л^

\_-/ "[ >—(

во

¦у

а

основание = аЭенин или гуанин

Значение этих высокоэнергетнчеекп.х циклических структур для биологических функций циклонуклеотндов еще не выяснено,

Биоорганическая химия фосфатов

145

Однако высказано предположение, что они необходимы для связывания циклических нуклеотидов с регуляторной субъединнцей протеинкиназы путем образования ковалентного промежуточного соединения. Например, карбоксильная группа в составе регуляторной субъединицы могла бы взаимодействовать с циклическим фосфатом так, чтобы в результате происходило раскрытие цикла и образовалось высокоэнергетическое промежуточное соединение. При этом могло бы нарушаться электростатическое взаимодействие регуляторной и каталитической субъединиц, что привело бы к пх диссоциации:

основание

Каталитическая сибъеоиница

основание

гуляторная сиБъевиница

~/ ^ ~ QJ V Д., он

основание= аЗенин или гуанин

Известно, что шестичленные циклофосфаты обычно уже не высокоэнергетическне соединения. Другими словами, в отличие от пятнчлеппых циклов шестичленные циклофосфаты имеют ненапряженную структуру (отсутствует искажение валентных углов). Это следует из сопоставления энтальпий для этилен-, три-метилен- и тетраметиленфосфорной кислот:

каталитическая,, сиоЧевиницо.

о/ ОН ^tfiUflp = -2б,9кДж/моль (-Б,4 ккал/моль)

С

о6

о9

.С

Ol Л °/>9 ХР^ НО^^-О—

-О ОН •^ягивр= -12|бкДж/моль (-3.0ккал/Ло.ль)

О

С

УС но-о он

к

о9 о9

i ^ягуар=-9,2кдж/моль (-г^ккдл/мда»

116

Глава 3

Природа основания не определяет энергетические свойства соединения. Именно наличие эфирного кислорода рибофуранозного цикла в транс-положении к шестичленному циклофосфату считают ответственным за высокоэнергетичность цнклофосфата, а замена фуранозного кольца на пиранозное (глюкоза) или цнкло-пентановое (т. е. эфирный кислород заменен метиленовой группой) приводит к тому, что такой циклофосфат обладает значительно меньшей энергией.

Биосинтез сАМР и cGTP требует высокоэнергетического предшественника: АТР или GTP. Ферменты, катализирующие эту реакцию, аденил- и гуанилциклазы, уже списаны выше.

о о о

ео—рорсР-р—ОСН2 основание ОСН2 основание

Hif %он V \>н

основание=аЗенин или гуанин

Химический синтез цнклопуклеотндов можно провести по аналогии с биосинтезом этих соединений: циклизацией ангидридного аддукта аденознпа. Поскольку циклофосфат — это высокоэнерге-тнческнй продукт, использование промежуточного соединения ангидридной природы, получаемого, например, при реакции с кар-бодннмидом, приведет к тому, что циклизация будет термодинамически выгодна. Следовательно, при сильном разбавлении в при-

Биоорганическая химия фосфатов

147

сутствии ДЦГК пройдет циклизация аденозин-5'-фосфата и образуется сАМР. При этом, однако, в значительной мере может пройти образование пирофосфата.

В другом варианте синтеза, позволяющем избежать образования пирофосфатов, циклизацию проводят с помощью сильного нуклеофил а — алкокснда. Для этого используют одно из самых сильных оснований — трет-бутплат калия в днметилсульфокснде. Конечно, необходимо присутствие хорошей уходящей группы.

о Id бн I О" 'он

ее О

в

Сходный метод был использован для синтеза фенилфосфотриэфи-ра уридинциклофосфата (cUMP):

O- J )~\ A»*° PhO—P- / %

> б Ьъ и о4 t)z

PhO J OPh О Z = защитная группа

Циклический продукт в высшей степени чувствителен к влаге (гидролиз); гораздо легче выделяется циклический диэфир. Наблюдалась интересная зависимость: фениловые трнэфпры высо-коэпергетических циклофосфатов (циклонуклеотидов, этиленфос-фата) весьма реакцнонноспособные, неустойчивые (легко разлагаются) соединения. В то же время фениловые триэфиры низкоэнергетических циклофосфатов — это стабильные кристаллические соединения. Например, фениловый триэфир триметиленфосфор-ной кислоты — кристаллический продукт, он получается легко и с высоким выходом при взаимодействии 1,3-пропандиола с фе-нилдихлорфосфатом.

О получении феннлового трпэфира сАМР подобным методом не сообщается.

148

Глава 3

3.5. Биосинтез полинуклеотидов

Синтез (репликация) ДНК должен происходить таким образом, чтобы образовались две новые цепи двухтяжевой ДНК с той же самой последовательностью оснований, т. е. тон же генетической информацией, что и родительская. Благодаря такому процессу из данной родительской клетки возникают две дочерние. Репликация становится возможной потому, что двухтяжевая родительская ДНК разделяется на отдельные нити, из которых каждая служит матрицей для синтеза новой спирали. Если бы две цепи были ковалентно связаны, энергия, необходимая для разделения цепей, была бы весьма значительной. Сохранение последовательности оснований в процессе репликации происходит благодаря высокой специфичности при образовании водородных связей между пуриновыми и пирнмидиновымн основаниями. Так что, например, аденин на одной цепи двойной спирали всегда будет находиться напротив и образовывать водородные связи с тимином во второй цепи. При разделении цепей аденин из одной цепи всегда будет взаимодействовать с тимином в процессе синтеза новой комплементарной цепи. Аналогичным образом тимин, который находился напротив аденина в родительской двойной спирали, после разделения цепей будет взаимодействовать в процессе синтеза новой комплементарной цепи с аденином. Следовательно, на каждой нз разделенных цепей родительской двойной спирали, как на матрице, синтезируются две новые цепн двухспиральной ДНК, обладающие совершенно одинаковой последовательностью оснований с родительской молекулой. Такой механизм синтеза ДНК называется полуконсервативным механизмом репликации, поскольку исходная двойная спираль «наполовину сохраняется» (рис. 3.9), т. е. каждая из двух образовавшихся двойных спиралей содержит одну цепь из родительской молекулы.

Конечно, по мере того как новые основания сближаются с матричной цепью, они должны вступать в реакцию полимеризации, давая комплементарную цепь. Для этого две мономерные единицы образуют между собой 3',5'-фосфодиэфнрную связь. Ферментом, который катализирует такую реакцию полимеризации, является ДНК-полнмераза. Как и в случае образования пептидной связи, для образования фосфодиэфирной связи затрачивается определенная энергия. Следовательно, мономерные единицы нельзя последовательно присоединять в форме монофосфатов, но следует сначала активировать, превратив в трифосфаты. Для обеспечения правильной последовательной полимеризации ферменту необходимо присутствие родительской цепи в качестве матрицы. Помимо этого для фермента необходимо присутствие затравки ДНК, с которой начинается синтез новой цепи. Следовательно, имеет место не синтез совершенно новой цепи, а удли-

Биоорганическая химия фосфатов

149

нение цени затравки. Это нетрудно понять, так как, если бы для фермента требовалась только матричная ДНК, он мог бы начать синтез новой цепи в любой точке матрицы, а не сначала (т. е. продолжая затравку). Это имеет особое значение, поскольку фермент полнмераза связывает своим активным центром не всю молекулу ДНК, а лишь ее небольшую часть. Ниже приведена катализируемая ферментом реакция.

или

затравка матрица \>сн2

n Th=Ad п СН,0

о)

- // о

О/

I

\ ? о=р-ое ( I

t > G\VNCH2°

w

I

о=р—os

су л сн2г

3 •а

с -в

J б -в с

о

о=р—о

I

о

/