^-Оу°"Лу/°\7Ь ')CHj0_Ph"l~C! HO-W) Тп О \ / пириВин, А * \_/

0^ Я NaOH ^"""^

но* (f .Ph

С—PhOCH3

Ph

n-Нитрофенилхлорформиат обладает меньшей селективностью, но также находит применение. В реакции с цыс-диолыюй группировкой хлорформиаты и

в Зак. 64В

162

Глава 3

дифеиилкарбонаты образуют циклический карбонат:

(Ph)3C 0 основание ° (Ph)3C 0 основание

Y V V RQ-^-g «пи Y Vх Y

О \ / (PhQhC-o о \ /

не/ Ън T о

Циклические карбонаты можно удалить мягкой щелочной обработкой

трет-Бутилдиметилсилильная группа

Первоначально силилирование углеводов и нуклеозидов использовали для приготовления образцов в газовой хроматографии и масс-спектроскопии. Однако в настоящее время силильные соединения, особенно трег-бутилдиметилсилиль-ная группа (/-BDMS), используются для блокирования гидроксильных групп. Обычно предпочитают объемистые группы благодаря их повышенной селективности к первичным гидроксилам и достаточной устойчивости к изомеризации даже в случае рибонуклеозидов, обладающих 1,2-цм-диольиой группировкой. Ниже приведена реакция тимидина с некоторыми снлнльнычи реагентами.

носн20 Th

ХУ

имиЭшол/ДМФА

но

ROCH^o Th НОСН^о Th ROCH^o Th

HO

RO

RO

R еь хоЗ, % h Б 6

82 2 4

триизопропилсили

тетраметиленизо пропилсилил 1 35 6 46

-bf- 73 1 IS

I трип- бутилвиметилсилил

Все силнлирующие реагенты обладают свойствами, которые делают их удоб-J ными гидроксилблокнрующими группами. Они проявляют разную реакционную активность к первичным гндроксильиым группам, но при избытке силнлирующего

Биоорганическая химия фосфатов

163

реагента способны взаимодействовать с любыми вторичными гидрокснльными группами. Значительного силилирования гетероциклических оснований тем не менее ие происходит. Силильную группу можно удалить кислотным гидролизом (80%-ная уксусная кислота) либо в нейтральных условиях обработкой фторид-ионом (чаще всего в виде тетрабутиламмоиийфторида, реже — фторида цезия илн тетраэтиламмония). Силильные эфиры достаточно кислотолабильны. Помимо этого, особенно при присоединении /-BDMS, легче всего гндролизуются первичные силильные эфиры. Таким образом, возможно синтезировать 3'- или 5'-мопоси-лнльное производное дезоксирибонуклеозида лишь с небольшой примесью побочного продукта.

HOCHi

Th

l-BDMSCI

—I—Si—ОСН

Th

НО

I

U

в

но

избыток. i-BDMsa

-ОСН2 Th НОСН2 Th

/ 60%?ая ДсОН i°!

ео'/,кП1.ДсОН-тимиацИ г5ч, го°с

Si—О

-fsi-б

Благодаря гидрофобности енлилированиых нуклеозидов любые побочные продукты можно отделить с помощью обычных приемов органической химии (хроматография на силикагеле). Фторид-иои в безводных средах — хороший нуклеофил. Силильная группа устойчива к обработке основаниями и гидразингидратом.

-)-Si-Q>CH, Th НОСН2 Th

но* но*

/ BDiMS-группа оказывается полезной и для синтеза определенных защищенных рибонуклеозидов. При этом она также предпочтительно силилирует первичную гидроксильную группу. В присутствии избытка силилирующего агента образуется смесь 2',5'- н 3 5'-диенлнльных производных. В зависимости от условий реакции и природы гетероциклического основания количество 2',5'-изомера равно или больше, чем количество 3',5'-диснлильного производного. Такое направление реакции полезно при синтезе рибонуклеотндов, для которых требуется блокирование 2'-гидрокснлыюй группы, но наличие свободной З'-гидроксилыюй группы для образования фосфодиэфнрной связи. Эти дна изомера можно разделить хроматографией на силикагеле. Дополнительное введение силилирующего

6»

164

Глава 3

агента приводит к полному снлилироваиию нуклеозида.

, I

НОСН2 основание —J—SiOCH2 основание

Ь°ч7 __^omscu 1 1А/

\7 имиваюл/дмФА V /

| I пиривии I |

НО бН НО ОН

i-BDMSO

1 1 I ' I '

—J-SiOCH2 основание —f-SiOCH2 основание —|-siOCH2

I

основание

-f-sio 6si4- ~Н;° °н н° ^+

Учитывая, что первичная стильная группа легко гндролнзуется, удается получить 5'-, 2'- или З'-г-ВОМБ-нуклеознды, а также 2',3'-, 2',5'- п 3',5'-днснлильные производные. На практике, поскольку п-метокситрнтильная группа более чувствительна к кислотному гидролизу, чем первичная силильная группа (помимо прочих соображений), специально с этой целью в нуклеотидном синтезе получены 5'-0-л-метокситритил-2'-/-ВОМ5-защищенные нуклеозиды.

Очевидно, что для реакции снлилироваиия необходимо не только наличие основания для связывания кислоты, но и нуклеофильный катализатор. Скорость реакции при этом меняется в следующей последовательности: триэтиламнп •< пиридин < имидазол.

Тетрагидрапиранильная группа

Использование дигидропирана для блокирования спиртов хорошо известно. Как блокирование, так и удаление защитной группировки происходит в присутствии кислоты:

г,Э-вигиВропиран эашр тетрагиЭро

лирана

Эфир тетрагидропирана (ТГП) устойчив к действию оснований. ТГП-группу (см. ниже) использовали для синтеза 2'-защишениых рнбонуклеозндов. Как указывалось ранее, для синтеза 3',5'-фосфодиэфирнон связи необходимо блокировать 2'-гидроксильиую группу. Однако наличие в ТТП-блокнрованном продукте

НО^ НО.

] о основание

о основание ^| о oci

^ = Н = = н

но ov= л но а.

центра асимметрии может усложнить его выделение при различных процедурах: в ходе обработки продукт ведет себя как два соединения, характеризующиеся

Биоорганическая химия фосфатов

165

различными Rf, температурами плавления и т. д. Этот недостаток был преодолен использованием вместо 2,3-дигидропирана 5,6-дигндро-4-метокси-2Н-пираиа. Соответствующий эфирный продукт симметричен.

Был проведен синтез 2'-защищенных нуклеозидов через промежуточные 2',3'-цнклические ортоэфнры. Ортоэфир блокирует 2'- и З'-гидроксилы, так что при необходимости можно селективно защитить первичную гидрокснльную группу. Гидролиз полностью защищенного нуклеозида кислотой (например, муравьиной илн уксусной) приводит к образованию смеси 2'- и З'-ацилнрованных изомеров. Для нх разделения обычно используют перекристаллизацию или колоночную хроматографию. Например, З'-О-ацетнладенозин из горячего абсолютного этанола кристаллизуется отдельно от 2'-0-ацетиладенознна. В выделенный З'-изомер

НОСН,

01

но он

основание

R'OCH,

I) RQOMel,,

2) R—,аншвриВ или кислота + ДЦГК; и т й

R =—Н.триметлилортосрормиот к =—СН3,триметилортоацетат к' = (рормил,меток.си- или фенокси-ацетат, певулинил и т.8.

I 01 FTOMe

основание

II) н« 2) кристаллизация и/или хроматография на силикагеле

носн2

I л основание

R'OCH,

осн, I о(

¦6- и

основание

НО о. сн3о

о

2) NH, или

NaOCHj, ийаление 5' защитной гриппы (если нужно)

о он

о=с

R

можно ввести тетрагидропнранильную защиту (в том числе и по первичной гидро-ксильной группе, если она не блокирована) и затем удалить ацильную группу щелочной обработкой с образованием 2'-защнщенного нуклеозида со свободной У-гидроксильной группой. В зависимости от выбора защитной группы для первичного гидроксила он может оставаться блокированным (например, если защищен левулинильной или тетрагидропиранильной защитой) илн деблокироваться (например, при использовании формильиой, метоксильной, феноксиацетильной групп).

Другие защитные группы

Для 1,2- и 1,3-цнс-диодов можно сказать, что классичеокой защитой является изопропнлпденопая (ацетоиидная) группа. Кисютолабнльный кеталь образуется при реакции рибонуклеозида с ацетоном в присутствии кислоты (НС1,

166

Глава 3

л-толуолсульфоновой, H2SO4) и соединения для связывания воды (2,2-дпметокси-пропаиа, этилового эфира ортомуравьиной кислоты). К блокирующим группам подобной природы относятся также бензилиденовая и цнклогексилиденовая.

НОСНг НОСН2

I ^основание о основание

У( +сн3сснз —^г уУ

HO OH н.с-с-сн, б. Ь

оси, Ъ<(

Н3С СНЭ

Предложены блокирующие группы, которые можно удалять ферментативным расщеплением. Преимущество таких групп состоит в том, что деблокирование происходит при очень мягких условиях (близкое к нейтральному значение рН, 37°С) и с высокой специфичностью. Например, дпгидроцнаннамоильпая группа (которую вводят в виде хлорида) может удаляться обработкой а-химотрип-сином.

N02

дигидроциннамоил- бснзоилформил- 2,4-динитробензол-хлорид хлорид сульфснилхлорид

Из других защитных групп можно назвать бензоилформильную (которую вводят действием бензоилформилхлорида и удаляют обработкой водным пиридином) и 2,4-динитробензолсульфеннльную (которую вводят действием соответствующего сульфенилхлорида и удаляют гпофенолом). Фотолабильпая о-нитро-бензильная группа, о которой уже упоминалось как о группе для защиты аминокислот (гл. 2), находит применение для блокирования 2'-гидроксильиой группы *.

3.6.3. Блокирование фосфатных групп

На основе сведений о различных защитных группах, пригодных для блокирования гидроксильных и аминогрупп, можно синтезировать защищенные нуклеозиды, в которых реакционно-способные группы образуют только З'.б'-фосфодиэфирную связь. Нежелательные продукты (З',3'- или 5',5'фосфодиэфиры, фосф-амиды и т. п.), скорее всего не образуются. Показательный при-

* Новейший обзор, посвященный использованию фотоактивируемых защитных групп в органическом (аминокислотном, нуклеотндном) синтезе, см. работу

Биоорганическая химия фосфатов

167

¦ер — конденсация аденозина и уридина:

NHCOPh j?

MeOPh-c—осн2 о n-4N^ + носн2^ n o-si+ U

H3C CHS

HO

I) H,po„—2H,0 I 2) H* NHjNHj

HOCH3

# o%

О И OH ааенилил-(3,-.5')-1)р.иЗин P—ОСНг г) /

I e° w

HO OH

После завершения реакции защитные группы можно удалить в ргких условиях, не затрагивающих фосфодиэфирной связи. На ¦том основан фосфодиэфирный метод синтеза полинуклеотидов. Шродукт реакции — фосфодиэфир со свободной, потенциально рязвимой для воздействия, отрицательно заряженной группой. Шалее, с увеличением длины полинуклеотидной цепи число отрицательных зарядов в соединении также будет увеличиваться. [Поэтому в зависимости от условий реакци