войств каталитического центра, что может играть важную роль в увеличении ферментативной активности при активации зимогена.

Получены данные о том, что в процессе гидролиза п-анилид-ных производных пептидов, катализируемом сериновой протеа-зой из Myxobacter 495, которую называют ос-литической протеа-зой, возникает тетраэдрический интермедиат и происходит согласованный переход протона от Ser-195 к His-57 и от His-57 к Asp-102. В этом ферменте присутствует только один остаток гистидина [82, 83]. Стадией, лимитирующей скорость гидролиза, является разложение тетраэдрического интермедиата на ацилфермент и л-нитроанилин. Экспериментальные данные говорят в пользу того, что два перехода протонов осуществляются согласованно, а не последовательно.

К удивлению, работы по 13С-ЯМР-спектроскопии [84] показали, что группой, рКа ионизации которой равна ~7, является спрятанная Asp-102, а не His-57, как ожидалось, т. е. при рН 7—8

Asp-102-

Asp-102

His-57-4»

О

Ser-195

О

H—He .N—H

н

+cu6crnpam-

His-57—,

P

e

H—N N

PK = 6,7

^Ser-195

гидрофобнуй каоман, I обеспечивающий /О—^ проЭуктпивное H \ связывание субстратси

R—NH—С—R2 fc

Asp-102

Asp-102

His-57

P.

r

о

Ser-195

N N—H I

/ ^kJ 4 --\,C—R R-N^l -) H тетраэЗрическлщ интермевиат

-R.NH,

His-57-

О

^,Ser-195

О ацширермент, который hq накапливается,

О?

а легко гидролиттся-

.""ГКЛ ^ОН^С

Asp-102

His-57

2-4

О

Ser-195

N^N-H

О—H

О т второй тетрйэйрический .интермевиат

С—R,

НО

0е

Рис. 4.3. Система «с переносом зарядов» a-химотрипсииа (положение 3 имида-звдьиой группы часто называют N61 или л, а положение 1—Ne2 или т).

Химия ферментов

223

Ser-195

Asp-102

Asp-102

His-57

+ R2—COOH

ионизуется и ухоВит uj полости фермента

вторая молекула субстрата готова войти,и процесс повторяется

Рис. 4.3. Продолжение.

имидазольное кольцо - при катализе остается непротонирован-ным. Однако подробные исследования химотрипсиногена, а-химо-грипсина и трипсина методом 'Н-ЯМР-спектроскопии, проведенные Маркли и сотр. [85], говорят в пользу первоначального предположения Робиллара и Шульмана [86] о том, что \>Ка His-57 выше, чем для Asp-102 как в зимогене, так и в ферменте. Основываясь на этом и других доводах, Маркли склоняется в пользу следующего механизма образования тетраэдрического интермедиата, который является вариантом механизма, приведенного на рис. 4.3:

His-57^ ^Ser-195

О

Г

Asp-102—С' /=-\ О

О—Н—N .N*— Vl

I

R2—NH—С—R,

У

о

His-57

Asp-102—С

О

Г

Ser 195

О—Н—N.a>.N—Н---0

^ VV

.HN—С—Rt / I

224

Глава 4

Кроме того, данные 'Н-ЯМР ясно указывают на существование ионной пары His-57—Asp-102 [86], что делает маловероятным согласованный переход двух протонов.

Последние работы [87] по рентгеноструктурным исследованиям а-литической протеазы показали, что Asp-102 находится в сильно полярном окружении и имеет р/(0 = 4,5. Далее, с помощью гистидинового ауксотрофа Myxobacter 495 [88] в состав а-литической протеазы был включен гистидин, обогащенный ,5N. Изменение спектров 15Ы-ЯМР такой а-литической протеазы, меченной по «каталитической триаде», в зависимости от рН ясно указало на существование водородной связи между NH-группой в 3-по-ложении гистидина (N61) и соседней спрятанной карбоксильной группой аспарагиновой кислоты.

Впоследствии Комияма и Бендер [92] выдвинули предположение, что протон, оторванный от гндроксильной группы серина имидазольной группой гистидина, переходит к атому азота уходящей группы амида, прежде чем завершается образование связи между карбонильным углеродным атомом амида и атакующим атомом кислорода серина.

Было бы крайне интересно знать значение рКа для His-57 активного центра в переходном состоянии реакции, катализируемой а-химотрипсином. В этом направлении вновь сосредоточила усилия группа Маркли [90]. Они изучали зависимость химических сдвигов ряда диизопропилфосфорилсериновых (ДФФ-сери-новых) протеаз от рН методом 31Р-ЯМР-спектроскопии. Значения рКа, полученные в процессе такого титрования, согласуются со значениями рКа, полученными ранее из данных 'Н-ЯМР-спектроскопи-ческих исследований для пиков, отнесенных к атому водорода в положении Cel-H (С-2) His-57 каждого из этих ДФФ-производ-ных. Интересно, что рКа трех изученных ферментов (а-химотрип-син, трипсин и а-литическая протеаза) повышается (до двух единиц в случае а-литической протеазы) при образовании производного по остатку Ser-195. Поскольку сериновые протеазы, ингибирован-ные с помощью ДФФ, можно рассматривать как аналоги переходному состоянию [91], Маркли предположил, что более высокие рКа для His-57, которые при этом наблюдаются для его! производных, могут приблизительно соответствовать рКа в переходном состоянии. Более низкое значение рКа His-57 в свободных ферментах подтверждает, что остаток имидазола при физиологических значениях рН находится в непротонированнон форме [90]. После того как образуется ферментсубстратный комплекс и достигнуто переходное состояние, рКа His-57 повышается, что делает имидазол более сильным основанием при связывании протона гндроксильной группы Ser-195. Здесь хорошо видно, как биофизические методы ('Н-, 15N-, |3С- и 31Р-ЯМР-спектроскопия) сыграли ключевую роль в установлении истинного механизма действия сериновых протеаз. Было показано, что механизм действия

Химия ферментов

225

трипсина, протеазы млекопитающих, и субтнлизнна, бактериальной протеазы, сходен с механизмом действия а-химотрнисииа. Хотя полнпептндиые цепи а-хнмотрнпсина и субтнлизнна свернуты совершенно различными способами, аминокислотные остатки, участвующие в катализе (серии, гистидин и аспарагииовая кислота), располагаются в пространстве одинаково. Такое сходство активных центров представляет собой первый пример конвергентной эволюции в геометрии активных центров ферментов [77].

4.4.1. Тетраэдрические интермедиаты

Установление существования тетраэдрического интермедиата в реакциях эфиров и амидов, катализируемых ферментами, долгое время оставалось одной из основных задач при изучении механизма действия ферментов. Поэтому большое внимание уделялось механизму катализа сернновых протеаз, основанном на большом количестве данных, полученных при химических и рент-геноструктуриых исследованиях. В 1979 г. [89] были выявлены тетраэдрические интермедиаты фермента млекопитающих эласта-зы. Тетраэдрические интермедиаты были обнаружены, наработаны и стабилизированы при высоком значении рН (10,1), отрицательных температурах (—39°С) в жидких водно-органических криорастворителях с использованием в качестве субстрата п-нит-роаннлидов ди- и трипептидов. Принимая во внимание температурные условия и состав растворителя, можно утверждать, что скорость образования интермедиата находилась в хорошем соответствии с результатами, полученными при 25°С в водных растворителях методом остановленного потока. Эти данные необходимы для будущих кристаллографических криоферментативных исследований. Участие имидазольной группы в механизме действия сернновых протеаз вызвало усиленное изучение реакции гидролиза эфиров, катализируемой имидазолом. Например, изучение многих модельных соединений показывает, что гистидин способен выступать в качестве нуклеофила во внутримолекулярных реакциях. Один из первых примеров — гидролиз н-нитрофе-иилового эфира в присутствии -у-(4-имидазолил) масляной кислоты [93]:

HN'

OPkNOa

ч

СООН

н,о

^Ж^о + но

N02

N=

анапог ацилферменш.а

8 Зак 549

226

Глава 4

При рН 7, 25°С константа скорости этой реакции (200 мин-1) сравнима с константой для расщепления л-нитрофеиолята а-хи-мотрппсином (180 мин-1). Стадией, определяющей скорость реакции, является ацилирование (ks). В первом приближении это удовлетворительная модель для имитации образования промежуточного ацилфермента, хотя His-57 в а-химотрипсине действует как общеосновпой — общекислотный, а не нуклеофнльный катализатор.

Как указывалось в предыдущем разделе, близкое геометрии ческое расположение триады Asp-His-Ser в активном центре се-риновых протеаз называлось системой с переносом зарядов. Эти группы находятся в гидрофобном окружении во внутренней области фермента, и атаке гндроксильной группой серина способствует отщепление протона по механизму общеосновного ката-, лиза имидазольным кольцом остатка гистидина. Это приводит к

частичному образованию сильного (не! /==\ сольватированного) нуклеофила — ал-

N кокси-иопа.

Роджерс и Брюс проделали обшир пые исследования с использованием модельных соединений, чтобы оценить вклад системы с переносом зарядов R = H,so3e [94—97]. Для модельного соединения скорость гидролиза ацетильной группы была в 104 раз выше, чем в смеси фенилацетата и имидазола. В зависимости от условий эксперимента предложены три схемы механизма катализа: 1) при низких рН

Ще J4— Н

СН3

Атака Н20 ускоряется по механизму обще-кислотиого катализа.

2) при нейтральных рН

HN

v/^H.

¦О^СНз

Атака Н20 ускоряется по механизму обще основного катализа.

Химия ферментов

227

3) при высоких рН

О

СНз

послеоующиц HjO* гивроли»

При высоких рН переход ацнлыюн группы 0-»-N к имидазо-лид-аниону происходит по иуклеофильному механизму. Последующий гидролиз ацилимидазольного промежуточного производного происходит благодаря тому, что скорость гидролиза превышает скорость термодинамически невыгодного перехода N-vO. Такая модель действительно имеет определенную аналогию с действием сернновых протеаз, хотя механизмы сходны лишь при нейтральных рН. Однако введение карбоксильном группы приводит к более точной аналогии системы с переносом зарядов:

Введение карбоксильной группы, образующей водородную связь, действительно увеличивает катализ соседним нмндазоль-ным остатком и обеспечивает согласованный общеосновной гидролиз. Однако скорость гидролиза эфиров повышается все еще незначительно (только в три раза), так что, говоря о ферментативном катализе, таким изменением скорости можно пренебречь.

В чем заключается влияние растворителя? Участвуют ли молекулы во