ды в реакции гидролиза?

Эксперименты с менее полярными растворителями не обнаруживают влияния их природы на функцию карбоксильной группы. Следует ожидать образования водородной сн связи между карбоксильной группой и нмндазо- \Ф^Н лнй-ионом. Действительно, для цвиттер-иоиа од- сн 9: нозначно показано существование водородной свя- (^^уС<9 зи. Оказалось, что реакция ОН- с протоном, уча- If ° ствующим в образовании водородного мостика, протекает в 103 раз медленнее, чем контролируемая диффузией реакция с аннлпннн-ноиом [96]. Так что с понижением концентрации воды в среде (понижение диэлектрической проницаемости)

228

Глава 4

можно ожидать как усиления дипольиых взаимодействий, так и повышения тенденции к образованию водородных связей, чего не было показано для модельного соединения Брюса.

Тем не менее модель Роджерса и Брюса поддерживает гипотезу переноса зарядов, поскольку имеются данные о существенном ускорении реакции в случае использования почти безводного ацетонитрила или толуола. В этих условиях система водородных связей «замкнута» внутри молекулы и не обменивается со средой, т. е. возможна реализация механизма при нейтральных рН: атака молекулой воды, сопровождающаяся общеосновным катализом, причем диполярное переходное состояние образуется из нейтрального основного состояния. В ацетонитриле это могло бы произойти только в присутствии находящегося рядом карбокси-аннона.

Как достоинство предложенной модели можно отметить то, что она позволила впервые выделить тетраэдрическнй интермедиат в реакции переноса ацетильной группы [94]. Ниже приве-

4-2

рК. = 3,1; 6,2; 9,8 ИКС:1710,1640 см

4-1

ИКС: 1780, 1645 см"1

CH,coci.nupuflim 1 Эень

NaBH4

обо. 1,65.5

/

оба 1,335

СН3

СООН

у=( ХН2ОН

он

е

o3s'

4-3

ИКС: 1780, 1730, 1645 см ~1

6 = химический сВеиг, (в м.о.)

4-4

рК. = 5.8;8,9

Химия ферментов

229

jjeiia схема реакции. Превращение 4-1-»-4-3 протекает через про-Яёжуточный N-ацилимндазол. В пользу этого свидетельствует следующее. Согласно экспериментам по конкуренции в присутствии амина, выполняющего роль основания, атака карбоксильной группы соединения 4-1 приводит к соответствующему амиду (4-3). Исследования методом ЯМР-спектроскопии показывают неэквивалентность двух геминальных метальных групп в 4-1, но не в 4-2 или 4-3. Это вызвано жесткостью структуры и асимметрией тетраэдрического интермедиата. Далее, восстановление 4-1 до 4-4 боргидрндом указывает на наличие лактоновой группировки. Восстановления соединений 4-2 пли 4-3 не происходит.

Образование 4-1 из 4-2, вероятно, происходит вследствие атаки карбоксильной группой по N-ацетилпиридиниевой соли с образованием промежуточного ангидрида с последующим замещением имидазолом. Таким образом удалось впервые выделить и однозначно охарактеризовать лабильный ацильный тетраэдрический интермедиат 4-1, миграция ацильной группы в котором приводит к образованию продукта 4-3*.

Комияма и Бендер [98] также изучали системы с переносом юряда в сернновых протеазах. В качестве модельной системы они исследовали реакцию гидролиза этилхлорацетата, катализируемую 2-бензимидазолуксусной кислотой по механизму общего основного катализа.

О

Н—N-^-N -Н—О

О

По сравнению с самим бензимидазолом наблюдается восьмикратное увеличение скорости гидролиза, что указывает на общеосновной катализ с участием карбоксильной группы.

ноос-

HN N

N^V—СНз W

бенэимиВаэол р-но.фтилук.сусная N-метилимиВаэол гтслота

Однако одна только карбоксильная группа, как, например, в р-нафтнлуксусной кислоте, не способна обеспечить такой

* Недавно были выделены н охарактеризованы тетраэдрические аддукты свльноэлектрофильных кетонов и третичных аминов [358].

230

Глава 4

каталитический эффект. Поэтому в реакцию вовлечены совместно карбоксильная и имидазольная группы и молекула воды.

N-Метилимидазол также использовали в этой системе в каче! стве модели метилированного сс-химотрипсина. Оказалось, что. в этом случае полностью отсутствует гидролиз этилхлорацетата, согласно чему в системе с переносом зарядов оба атома азота! имндазольного цикла должны быть свободны для участия в ре-'| акции.

Исследовались также свойства сс-химотрипсина, метилирован^ ного по His-57, для объяснения механизма действия этого фер-' мента. Метилированный сс-химотрипсин примерно в 105 раз активнее сс-химотрипсина [99]. Результаты исследований говорят о том,1 что общеосновной катализ остается составной частью механизма^ гидролиза модифицированным ферментом.

Хотя при метилировании His-57 в активном центре происходят лишь небольшие изменения, переходное состояние и тетраэдриче-i ский интермедиат дестабилизированы по сравнению с нативным* ферментом. Участие гндроксильной группы в гидролизе эфиров и амидов также включает образование тетраэдрического интермедиата.

ООО

е || образование расщепление е

RO + R—С—OR' «=*Ь± R—С—OR' «==± R—С—OR + OR

OR

тетразВрйческий интермебиат

В зависимости от значения рКа уходящей группы образуются два переходных состояния:

о

-I | -а

RO--C--------OR'

I

R

переходное состояние" (сходно с продуктом)

-а RO

-г OR'

переховное состояние (cxqohq с исходным соединением)

Если переходное состояние тетраэдрического интермедиа™ сходно с продуктом реакции, то стадией, лимитирующей скорость, является расщепление тетраэдрического интермедиата, или А2<| <С k-\ (ki для заторможенного процесса, a для быстрого). Такая ситуация реализуется, если RO- — хороший нуклеофил или ] если его рКа меньше, чем рКа для Р/0--группы.

Если же переходное состояние напоминает реагент, то стадией определяющей скорость, является образование тетраэдрического! интермедиата, причем k2 > ft-i (ft-i для медленной реакции). В этом случае Р/О- — хорошая уходящая группа и ее рКа меньше!

Химия ферментов

231

N0,

чем р/\а для R0- (нуклеофила). Эти же рассуждения легко сде-лать, рассматривая гидролиз и-нитрофеннловых эфиров в присутствии метокси-аниона.

I Такой процесс протекает быстро, если 0 шклеофил — сопряженное основание слабой || ^ «слоты (метанол), а уходящая группа— R—с—О-копряженное основание сильной кислоты (рК, I мало). Следовательно, обратная реакцш. сн3о сильно заторможена.

¦ Таким образом, при хорошей уходящей группе (слабое ¦пряженное основание) стадией, определяющей скорость (медийной) при гидролизе эфиров, является образование тетраэдри-Ького интермедиата, а при плохой уходящей группе другая стадия—расщепление тетраэдрического интермедиата.

¦ Конечно, действие гидроксильной группы при катализе в определенной степени аналогично функции остатка серина в сернновых ¦ротеазах. Поэтому были синтезированы и исследованы модельные

рединения.

I Например, рассмотрим следующее внутримолекулярное превращение:

\\>Et

сн2ох

Ь + EtOH + Ht/\t

\=/

I Скорость этой реакции в 105 раз больше, чем в случае этилбен-|оата. При этой реакции имеет место основной катализ, и в присутствии 2Н20 вместо НгО, как и ожидалось, ее скорость понижается по крайней мере в два раза (?h/?d = 3,5). Таким образом, переход протона осуществляется в переходном состоянии, так что вналогия с сс-химотрипсином очевидна.

I Перейдем к другой интересной и простой модели амидного ¦налога [100]:

о

4NH2 СН2ОН

+ NH,

При низких рН происходит протонирование азота и —NH3 [ановится хорошей уходящей группой. При высоких рН, рнако, гндроксильная группа тетраэдрического интермедиата

232

Глава 4

превращается в лучшую уходящую группу. Была изучена реакция стабильной имидной формы:

Синтезированы и другие модельные соединения с приближенной аминогруппой. Ожидалось, что в положении 6 аминогруппа дестабилизирует тетраэдрический интермедиат и, следовательно, увеличит скорость реакции. Однако наличие аминогруппы в этом положении приводит к снижению скорости реакции в 10 раз.

стабильная ионная пара

Вероятно, силы притяжения б ионной паре стабилизируют тетраэдрический интермедиат, замедляя его расщепление.

Что же произойдет, если аминогруппа будет находиться в положении 3? Скорость реакции возрастет в 103 раз по сравнению

H3N О H2Nn О H2N С>

н—ОН

Ситуация ситуация неблагоприятная Благоприятная

с б-аминоаналогом. В 2Н20 отношение kH/kD достигает 2,82, что предполагает внутримолекулярный катализ с участием растворителя.

Химия ферментов

233

4.4.2. Абсолютная конформация связанного субстрата

Какова точная ориентация субстрата в активном центре? Каково положение расщепляемой связи относительно каталитических групп? Вот некоторые из тех вопросов, которым посвятили свои работы Ниман и Белл о.

Один из возможных путей для получения ответа на поставленные вопросы, вероятно, состоит в использовании простых модельных субстратов фермента сс-химотрипсина. С этой целью Хейн и Ниман [101] впервые попытались выяснить конформацию некоторых субстратов, присоединенных к сс-химотрипсину, используя молекулы с фиксированной конформацией, для моделирования конформации, которую принимает в активном центре типичный ациклический субстрат метиловый эфир 1Ы-ацетил-ь-фенилаланина (l-APME). Для этого Ниман изучал кинетические свойства d- и й-кето-3-карбометокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина (КСТТ). Это

N-f-C02Me НН

ксп

(соеЗинение Нимана)

соединение представляет собой жестко закрепленный аналог l-APME, а также метилового эфира N-формилфенилаланина (l-FPME) и метилового эфира N-бензоил-ь-аланина (ь-ВАМЕ), каждый из которых — хороший субстрат а-химотрипсина.

Хотя tz-химотрипсин стереоспецифичен If к L-изомерам большинства аминокислот-субстратов, Ниман показал, что в случае КСТ1 наблюдается обратная стереоспецифичность. t-Изомер этого конформацнонно закреплению эфира гидролизуется со скоростью, сравнимой со скоростью гидролиза метилового эфира N-ацети-шрованпого ь-феннлалаиина, тогда как ь-изомер гидролизуется очень медленно. Такое аномальное поведение соответствует требо-данию для карбоксильной группы d-KCTI занимать аксиальное

234

Глава 4

положение, т. е. положение, соответствующее возможному pacno-i ложению ациклических с