едов лактона. Чтобы объяснить этот результат, мы должны рассмотреть все возможные конформеры промежуточного соединения. Теоретически существуют девять [различных гош-конформеров тетраэдрического промежуточного гемиортоэфира. На рис. 4.6 представлены девять возможных кон-ррмеров циклического ортоэфира.

Следовательно, задача заключается в том, чтобы определить, какой из конформеров позволяет объяснить образование окси-как единственного продукта гидролиза. Согласно стерео-мектропной теории, продукт реакции должен иметь точно такую же информацию, что и тетраэдрическнй интермедиат, и расщепление алкильной связи С—О может произойти только в том .случае, если орбиталн двух других атомов кислорода этого интермедиата ориентированы антнпернпланарпо к алкильной связи С-0, подвергающейся расщеплению.

Итак, прн детальном рассмотрении каждого конформера ока-ивается, что пять из них —б, г, ж, з и и — можно не принимать to внимание вследствие сильных 1,3-сын-перипланарных взаимо-Кнствий между двумя этильнымн илн циклическими метилено-шуи группами. Поскольку в состоянии равновесия содержание п/х соединений очень мало, ими можно пренебречь. Конформер в икже следует исключить из рассмотрения в качестве реакционно-юобного конформера просто потому, что орбитали двух его мов кислорода направлены таким образом, что не способны вести расщепление связи С—О третьего атома кислорода.

246

Глава 4

В трех оставшихся конформерах а, д и е отсутствует какое-либо сильное стернческое взаимодействие, и каждый из них обладает двумя атомами кислорода с соответственно ориентированными орбиталями для расщепления С—О-связи третьего атома кислорода.

Расщепление каждого из этих трех конформеров приведет к образованию соответствующего диоксоленнй-иона, согласно только что упомянутому правилу соответствия ориентации ор-биталей. Теперь (при рассмотрении относительной стабильности каждого из этих диоксолеиий-ионов для конформеров а, д и е) очевидно, что структура д обладает ^ис-конформацией, а а и е — транс. Известно, что гранс-диоксоленнй-ион устойчивее, чем цис-изомер, по аналогии с более стабильными гранс-эфирами. Следовательно, расщепление конформера д — более высокоэнергетиче-скнй процесс, и эту структуру также можно исключить (см. рис. 4.6):

Et

L--o'-f L0

II

(Г

Et

О 1

Г-J^o*

L~---A* , л

Et

>

Et

д

О О

о^о^

О

'Et

О е

I

Et

О

o^.ov

Et

4Et

Труднее найти аргументы, чтобы сделать выбор между ко формерами а и е. Из общих соображений образование цикли ческого диоксолений-иона предпочтительнее образования ациклического, если исходный ортоэфир циклический. Далее, при расщеплении конформера а образуются две молекулы, тогда как из конформера е образуется только одна молекула. Взятый отдельно этот энтропийный фактор говорит в пользу конформера а по сравнению с конформером е как с реакционной частицей. Отсюда следует заключить, что циклический ортоэфир гидролизует-ся преимущественно через конформер а, даже если он существует в быстро устанавливающемся равновесии с конформерами е и д [114].

Был исследован большой набор ацеталей, эфиров н солей иминоэфиров, обладающих различной степенью подвижности структуры, причем всегда наблюда-1 лось согласие с этой теорией. Например, реакцией конформационно-жесткого бн-

Химия ферментов

247

Et

Et

1---9 0 *----оф л *-*"—о> I

О И

с,.:>*

CW^ Et

О'

О Et

Et

0 u

Et

Рис.4.6. Возможные, конформеры циклического ортоэфира [114]. Воспроизведено с разрешения. © 1975 by Pergamon Press Ltd.

циклического лактона с триметилоксоннйтетрафторборатом можно синтезировать иешлактониевые соли:

ОТ

(СН,):

СН3 ОСНз

Sv^>HiO/riOH

f^T^COOCHj

ср,о9,г----~т~-—-у^осщ

\

(вионсолениееая соль) смешанный ортоэфйр

СО

Линия с метнлатом натрия приводит к образованию днметокснэфира. В при-цтствии дептерироваиного метилата натрия с выходом > 90% был получен аиаииый циклический ортоэфйр, содержащий дентерированную метоксигруппу м>ко в аксиальном положении. Гидролиз ортоэфира в водной среде в присут-л-толуолсульфокислоты приводит к образованию только недейтернроваи-оксиэфира. Эти результаты подтверждают, что гидролиз циклических орто-ов проходит с отщеплением аксиальной алкоксигруппы, а также служит еще и доказательством того, что коиформер е следует исключить из рассмотрели возможный активный конформер и, следовательно, гидролиз циклнче-диалкоксиортоэфира происходит через конформер а Дальнейшее доказательство стереоэлектронного контроля при гидролизе эфи-1 амидов получено в экспепиментах по конкуренции реакций обмена кисло-

248

Глава 4

рода карбонильной группы и гидролиза эфиров с использованием соединений, ме-1 ченных |80 [116].

R—С—OR + Н20

*он о

II +

R—С—OR R—С—ОН + ROH*

ОН

О

И

R—С—<

OR + H20* ,80 = 0*

Если при стереоэлектронно-коитролируемом расшепленин действительно не происходит конформационных изменений в тетраэдрическом иитермеднате, то кон-, курентный обмен кислорода карбонильной группы в процессе гидролиза можно использовать, чтобы подтвердить и отсутствие конформационных изменений, и стсреоэлектронную теорию. Выдвинутые предположения позволяют сделать следующие предсказания: (Z)-эфиры могут участвовать в обмене кислорода карбонильной группы, а (?)-эфиры — нет*. Примером (?)-эфира может служить |вО-мечсный 6-лактон. Реакция с гидроксид-ноном приводит к образованию те-| траэдрпчсского интермедиата, обладающего необходимой ориентацией электронной пары чтобы расщепление прошло только в одном из двух направлений, либо с образованием исходного меченого эфира, либо продукта реакции.

о«^

(Е) JX

Меченый "41 *0He + Q=0 ^

немеченый 11

* Z- п ?-помснклатура для двойных связей и карбонильных групп молеку! основана иа приложении правил приоритета Кана — Ингольда — Прелога. Если две группы наибольшего приоритета на концах двойной связи расположены по одну сторону двойной связи (цис), конфигурация двойной связи обозначается Ж Если две группы наибольшего приоритета расположены по разные стороны двои ной связи (транс), конфигурация двойной связи — Е. Эти правила можно там применять для обозначения конформацин эфиров, рассматривая С—О-связь. По-скольку свободная пара электронов имеет низший приоритет, конформация обозначается как Z, если алкоксигруппа R расположена по ту же сторону, чтоИ кислород карбонильной группы. Если она расположена по другую сторону, кщ в случае лаптопов, конформация обозначается Е.

Химия ферментов

249

Поскольку тетраэдрическнп нитермедпат не способен образовать немеченый эфир, обмен кислорода в карбонильной группе не имел места в (С)-эфире. Результат этого эксперимента находится в соответствии с ранее описанными в литературе данными, показывающими, что обмен кислорода карбонильной группы в лактонах не происходит. В то же время при гидролизе (2)-эфиров всегда происходит обмен кислорода карбонильной группы с растворителем.

Результаты экспериментов с лактонами можно также объяснить, используя кинетические представления. Действительно, степень обмена в карбонильной группе меняется в зависимости от относительных величии k3 и к2. Если k3/k2 > 100, происходит очень медленный обмен, который трудно обнаружить. Это соображение согласуется с экспериментальными данными для (?')-эфиров.

4.6.2. Приложение к сериновым протеазам

Было бы разумно рассмотреть, насколько такие представле-ия применимы Для понимания механизма ферментативных реак-й. Похоже, что стереоэлектронная теория, разработанная Де-лоншамом и сотр., особенно подходит для случая гидролиза пептидной связи сериновымн протеазамн. Для иллюстрации этого подхода рассмотрим сначала гидролиз эфиров.

Промежуточный гемиортоэфир расщепляется с образованием двух эфиров, каждый нз которых имеет либо (Е)-, либо (Z)-кон-формацию.

I В соответствии с принципом микроскопической обратимости, при образовании гемиортоэфира атака алкокси-ионом на эфир также должна происходить под стереоэлектронным контролем.

Поскольку трансоидный (2)-эфир в общем более стабилен, чем соответствующий цисоидный (?)-эфир, используем этот пример, чтобы проанализировать атаку гидроксилыюй группой

R

СНз

О—сн3

трансоидный

.О

Senas

250

Глава 4

серина в активном центре. /Можно ожидать, что остаток серина приблизится к эфиру, ориентируясь в противоположную от более объемистой R-группы субстрата сторону.

Однако присоединение остатка серина к тетраэдрическому интермедиату приведет к возникновению значительного стериче-ского напряжения (~33,4 кДж, или ~8 ккал) из-за взаимодействия с алкокснцепью. Чтобы устранить это напряжение, в активном центре должно произойти изменение конформацин путем поворота вокруг связи С—О, соединяющей тетраэдрический углерод с сериновой ОН-группой, па 120°.

(?),unu цисоидный. (Z) или трансаидный,

ацилфер.мент аципфермент

Этот новый тетраэдрический интермедиат в конечном счете приведет к образованию цисоидного промежуточного ацилфер-мента, который, видимо, и будет основным продуктом.

Возможен также поворот на 120° группы —ОСН3. В этом случае эфирная группа меняет копформацию по отношению к группе R с транс- на гош-. Этот новый тетраэдрический интермедиат, а также исходный приводят к образованию трансоидного промежуточного ацплфермента после отщепления —ОСН3-группы, которому способствует взаимодействие с орбнталями.

Третий возможный конформер следует исключить из рассмотрения, поскольку его расщепление не может иметь места

Химип ферментов

251

иже после поворота —ОСН3-группы. Он представляет собой не-[родуктивиый связывающий интермеднат.

Однако, если трансоидно-цисоидная изомеризация эфирного субстрата под действием фермента происходит до атаки серино-ыы остатком, образуется другой тетраэдрический интермеднат:

/.О

к-<°

4 о—СН,

о

трансоидный

(Z)

СН3 ОН цисоидный I

№) СН2 /—-

С?а сн,

сн2

R^O

^Ч:н2

V

(ZJjUnu трансоидный, аципферментп

¦ этом случае стерическое напряжение ие столь велико, как П предыдущем, и такой интермеднат расщепится с преимущест-¦иым образованием трансоидного ацилферме