гидрофобных боковых радикалов;

3) обеспечить электростатическое связывание с высокой плот-остью заряда благодаря присоединенным к полимеру ионным рковым цепям.

302

Глава 5

В то же время как основные недостатки полимерных катализаторов можно выделить их ограниченную растворимость в воде и беспорядочное расположение полимерных цепей. Кроме того, кинетические кривые имеют более сложную форму из-за многоцентровой природы полимера в отличие от фермента, который обычно имеет только один активный центр.

5.4. Циклодекстрины

а-Циклодекстрин — это существующая в природе акцепторная молекула, состоящая из шести остатков l-глюкозы, связанных «голова к хвосту» а(1->4)-гликозидной связью и образующих кольцо, называемое циклогексаамилозой (рис. 5.15). Молекула а-циклодекстрина обладает относительно негибкой тороидной (напоминающей «бублик») структурой, с одной стороны которой находятся 12 гидроксильных групп, присоединенных по 2- и 3-поло-жениям d-глюкозных единиц, а с другой — 6 первичных гидроксильных групп, присоединенных по 6-положению, так что молекулы а-циклодекстрина имеют снаружи гидрофильные гидро-ксильные группы, в то время как в своем объеме — основной остов, включающий связи С—Н, С—С и С—О, достаточно гидрофобные по своей природе. Таким образом, принцип, на котором основана их структура, противоположен наблюдаемому для краун-эфиров,

Рис. 5.15. Схематическое изображение структуры а-циклодекстрина.

Моделирование ферментативных систем

303

имеющих довольно гидрофильные полости [173]. а-Циклодекстрин может образовывать нерастворимые кристаллические комплексы

ключения с самыми разнообразными донорными молекулами.

бычное соотношение донорной и акцепторной молекул в этих Комплексах составляет 1:1, а фактором, определяющим комп-лексообразование, является размер донора. Внутренний диаметр полости а-циклодекстрина (6 глюкозных единиц) равен 0,45 нм. Бензольное кольцо достаточно мало и способно проникать в цик-'лоамилозные циклы, составленные из 6, 7 и 8 звеньев. Что же касается антрацена, то только 8-членный цикл может разместить эту ароматическую систему. По-видимому, наиболее вероятно образование комплекса включения в результате гидрофобных взаимодействий. Кроме того, определенную роль могут играть водородные связи, вандерваальсовы силы и дисперсионные силы Лондона.

В Использовать циклодекстрины для биомиметической химии предложил Крамер (в 1965 г.), а также Летцингер, Моравиц и Бендер; эта идея получила дальнейшее развитие благодаря работам Бреслоу и Табуши. Бреслоу [174] первым показал, что в системе, содержащей а-циклодекстрин, может происходить селективное замещение в ароматическом кольце. Он обнаружил, что обработка водного раствора анизола (0,1 ммоль/л) при комнатной

¦лпературе НОС1 (0,01 моль/л) в присутствии избытка а-цикло-

екстрина приводит к 96%-ному хлорированию анизольного коль-La в пара-положении.

I Эти результаты свидетельствуют о том, что циклодекстрин не [только блокирует все, кроме одного, положения ароматического [кольца, но и активно катализирует замеще-не в незащищенном положении. На схеме ¦эказана молекула анизола, находящаяся в тэлости циклогексаамилозы. Превращением

мной или более гидроксильных групп в ги-

¦хлориты можно объяснить возрастание ско-

Ьсти хлорирования в комплексе. Это — один из примеров нековалентного катализа (классического связывания Михаэлиса — Ментен), при котором акцептор предоставляет свою полость для протекания реакции без образования ковалентного Промежуточного соединения.

В Аналогично и ароматические эфиры быстро гидролизуются р-циклодекстрином. В катализе участвуют, по-видимому, вторичные гидроксильные группы, но не известно, сколько и какие Именно. При перемещении ацильной группы к акцепторной молекуле циклодекстрина образуется интермеднат. Эта ситуация формально аналогична механизму действия гидролитических ферментов, таких, как сериновые протеазы, и может служить в качестве ,Модели фермента, поскольку перед началом реакции образуется Комплекс с субстратом. Такое превращение можно рассматривать

304

Гшва 5

как катализ с образованием ковалентного продукта (ковалентный катализ). Следует отметить, однако, что вторая стадия гидролиза эфира циклодекстрином протекает очень медленно, так что для этих реакций циклодекстрины не истинные катализаторы.

В группе Бендера [175] исследовали гидролиз т-трет-бутл-фенилацетата в присутствии 2-бензимидазолуксусной кислоты и а-циклодекстрина с целью изучения системы с переносом заряда при ферментативном катализе сериновыми протеазами. В присутствии катализатора наблюдалось 12-кратное ускорение расщепления эфира, связанное с образованием комплекса между субстратом и а-циклодекстрином. Это наблюдение согласуется с образованием ферментсубстратного комплекса в ходе ферментативных реакций. Однако пространственное расположение ими-дазольной, карбоксильной и алкоксильной групп, по-видимому, отличается от их расположения в сериновых протеазах. Серино-вые протеазы функционируют, используя в качестве нуклеофила алкокси-ион, в то время как в данной модели нуклеофил — имида-зольная группа. Усовершенствование этой системы стало возможным благодаря селективному превращению одной из вторичных гидроксильных групп в гистаминовый остаток. К сожалению, серьезное неудобство циклодекстринов заключается в том, что они недостаточно активны при нейтральных рН, а действуют только в щелочных условиях, так что кинетические данные, полученные при рН 13, нельзя сравнивать непосредственно с данными, полученными, например, для а-химотрипсина при рН 8. Молекула акцептора устойчива в щелочном растворе, но такие условия могут нарушить структуру субстрата. В то же время следует учитывать чувствительность акцептора к кислой среде.

Отметим также, что одна из главных проблем состоит в связывании субстрата; сорбционная полость недостаточно аполярна, открыта с обеих сторон и константы диссоциации циклодекстрино-вых комплексов больше, чем ферментсубстратных. Иммобилизация субстрата не всегда отвечает предъявляемым требованиям; обычно необходима высокая концентрация циклодекстрина, а конформация субстрата с наиболее низкой энергией можег

Моделирование ферментативных систем

305

цикло-5-5 цикло-5-6 цикло-5-7 цикло-5-8

цикло-5-9 цикло-5-1О

-ОН -OTs -nhch3 -NHCH2CH3

-СНО

-сн3

-сно -сн2сн3

/Рис. 5.16. Синтез «экранированных» молекул циклодекстрина [176].

-Ns

-N=

¦заться не самой оптимальной для катализа. Чтобы обойти кого рода трудности, Бреслоу [176] привязал объемистую ¦ппу к более активным первичным гидроксильным группам ^дной стороны молекулы а-циклодекстрина (циклогептаами-с внутренним диаметром 0,7 нм) (рис. 5.16). результате полость акцептора оказывается с одной стороны Мранированной» и по этой причине более гидрофобной и не-жбокой, т. е. образуется ацилциклодекстрин с «дном», которое ^спечивает более мелкое погружение субстрата при связыва-Далее были изучены следующие превращения (табл. 5.1):

|цикло-5-5, 5-9 unu5-10 +

СН,

«=t комплекс <==sp

R = -NOa = ~1Ви

ОН

ацетилцик.ло-5-5, 5-9 или 5-10 + R

В Реакции подчиняются кинетике Михаэлиса — Ментен. Цикло--9 (экранирование метальной группой) обеспечивает 10-кратное

306

Глава 5

Таблица 5.1. Константы скорости и константы диссоциации для реакций производных циклогептаамилозы с ж-нитро- и л-грег-бутилфенилацетатом [176]

Субстрат R Цикло- Wp-103-с-' Йвнутр/\)Н~ Кдисс-104' моль/л

—Ш2 5-5 П,9±0,05 64 57±7

—Ш2 5-9 123±5 660 51 ±7

—N02 5-10 210±40 1140 260±50

—трет-Ви 5-5 4,13±0,25 365 1,9±0,2

—трет-Ви 5-10 37 ±5 3300 4,6±0,9

увеличение скорости, а цикло-5-10 (экранирование этильной группой) еще большее. Сравнивались константы скоростей реакций в присутствии (/гВнутр) и в отсутствие (&он-) акцептора. Образование комплекса Михаэлиса — Ментен —¦ одна из причин, оправдывающих использование катализируемых циклодекстрином реакций для моделирования реакций гидролитических ферментов. Интересно, что наличие грег-бутильной группы в субстрате резко снижает константу диссоциации; это означает, что он лучше связывается; грег-бутилфенильная группа полностью заполняет цик-логептаамилозную полость. Следует также отметить, что если субстрат выталкивается «дном» из полости, то, как правило,

константа диссоциации меняется пропорционально скорости. В отсутствие «дна» ^соон субтрат располагается слишком глубоко и эффективного катализа не наблюдается, аиамшшанкарбоновая Ддамантанкарбоновая кислота, которая кислота г прочно связывается с а-циклодекстрином,

закрывая вход в полость, — великолепный конкурентный ингибитор комплексообразования.

При исследовании гидролиза замещенных фенилацетатов сбили р-циклодекстринами установлено, что лгега-замещенные фениловые эфиры гораздо быстрее гидролизуются, чем соответствующие пара-изомеры,— явление, названное лгега-селективностью. Эти наблюдения говорят о том, что способ связывания субстратов, по-видимому, асимметричный. Такой эффект, очевидно, зависит от глубины полости, и Фудзита и сотр. [177] показали, что соответствующие простые модификации (3-циклодекстрина, такие, например, как «экранирование» акцептора, могут менять селективность и превращать обычную лега-селективность в «ара-селективность.

Комияма и Бендер [178] представили еще одно экспериментальное доказательство важности гидрофобного связывания при комплексообразовании а- и {3-циклодекстринов с 1-адамантанкар-

Моделирование ферментативных систем

307

#боксилатом. Гидрофобное (неполярное) связывание характеризуется благоприятным изменением энтропии, которое можно объяснить переносом донорной молекулы из водной среды в более аполярную, какую представляет собой полость циклодекстриновой молекулы. Такой перенос требует разрушения слоя структурированной вокруг донора воды, что приводит к большому благоприятному изменению AS и небольшому неблагоприятному изме-книю АН. Важность гидрофобного связывания в комплексооб-эазовании циклодекстринов также согласуется с наблюдением, |iT