первым установил на основании данных ЯМР-спектроскопии, кто тиазолий-ион обладает кислотными свойствами и что водород при С-2

460

Глава 7

может обмениваться на дейтерий в тяжелой воде при щелочных значениях рН

сильная кислота или8 (Эиполярный ион)

В чем состоит роль пиримидиновой части кофермента? Можно лишь только предполагать, что аминогруппа при атоме С-4' достаточно близко подходит к водороду у С-2 и действует как слабое основание, облегчающее образование биполярного тиазолий-иона. Проведенные недавно 13С-ЯМР-исследования солей тиамина свидетельствуют о том, что это действительно имеет место, а рентгено-структурный анализ показал, что в кристаллических соединениях тиамина взаимная ориентация двух колец благоприятствует выполнению этой функции [325]. Такой процесс мог бы осуществляться с помощью фермента, и прото-нирование N-Г содействовало бы протеканию процесса. В самом деле, при наличии метильной группы у атома N-Г пиримидинового кольца в нем возникает положительный заряд, который придает этому производному тиамина более

,СН,

N-

СН,

CHj^KsT""!

СН,

СН,

рр

Н

V I

н

н

СН, N^NH.e^S

РР

не-

сильные каталитические свойства, чем у тиамина, участвующего в ферментативных реакциях [326]. Положительный заряд на пиримидине, по-видимому, ускоряет образование илида, декарбоксилирование и образование апетоина по сравнению с тем, что происходит в случае природного витамина.

Весьма вероятно [273], что фермент может стабилизировать минорный таутомер аминопиримидинового кольца. -При этом образуется система переноса заряда, в которой азот (в иминоформе) пиримидинового кольца способствует удалению атома водорода при С-2 тиазолиевого кольца.

Одно из удивительных свойств тиамина состоит в том, что тиазолиевое кольцо образует ковалентное промежуточное соединение с субстратом и может действовать либо как электрофил, либо как нуклеофил. Таким образом, этот катализатор способен выполнять двоякую функцию. Другими словами, электронная плотность может сдвигаться от расщепляемой связи к структурным

Химия коферментов

461

[элементам кофермента (в направлении к группе —N—), а затем обратно к

I

1 образующейся вновь связи. Например, илид имеет нуклеофильный карбанион, (который может конденсироваться с пировиноградной кислотой и другими а-ке-токислотами

R

А.

РР

сн3—с—соон

II

н9

СН,

•S'

н

i

СН3-^/

РР

но

РР

с=о

«к

ot-лактил-трр R\e

-к

Н Л

И

-со,.

mi

R =

СН,

сн—С^ +

R

Г s

S

РР

I Тиазолий-ион ведет себя как «хранилище электронов», или электрофил, и Происходит декарбоксилирование. В то же время енольное промежуточное со-[единение действует как нуклеофил и может протонироваться. Это промежуточное [соединение удалось выделить. Наконец образуется ацетальдегид и одновременно регенерируется кофермент (в форме нлида). Освобождение ацеталь-[дегида — вот скоростьлимитирующая стадия механизма действия пируватде-|карбоксилазы.

Следует ясно понимать, что нуклеофильное енольное промежуточное соединение (оксиэтилтиаминпирофосфат)— именно та форма, в виде которой кофермент, как правило, встречается в природе; эта форма может реагировать [с другими нуклеофилами, такими, как ацетальдегид (альдольная конденсация) 1(см. с. 462).

I Промежуточное соединение, таким образом, является мощным нуклеофилом ]и присоединяется по карбонильной группе с образованием углерод-углеродных [связей. Среда должна быть щелочной, чтобы обеспечить достаточное количество юлида, но в то же время и не слишком щелочной, иначе в значительной сте-¦ени произойдет раскрытие тиазолиевого кольца.

Вторая молекула пировиноградной кислоты также может присоединяться к этому же промежуточному соединению, давая после декарбоксилирования [молекулу ацетоина. Как сообщалось, в процессе реакции, катализируемой ферментом пируватдекарбоксилазой, обнаруживаются лишь следовые количества рцетоина.

462

Глава 7

N-

СН

ОН

оксиэтилтиаминпиро-фосфат (биологический „активный альВегиЗ";

9\s/\^"Npp — сн3-с-1

—сн:'

II

о

он

+ ТРР

сн3

ацетоин

Оксиэтилтиаминпирофосфат выступает в роли нуклеофила и в реакциях с липоевой кислотой. В природе липоевая кислота действует в паре с тиамин-

СН.

нУ

/ он

е

он

соое

о о

сн.

4-

СН,

-сн

?

V

сн,

ацетоин

5Г СНз-С-С-СООе + е/

он

рр

пирофосфатом. Это превращение соответствует восстановительному ацилирова-иию липоевой кислоты и впервые было постулировано Ингрехемом [327].

Интересной особенностью механизмов этих реакций является превращение пировиноградной кислоты (тип ^,C=OJ в ацетилтиоэфир липоевой кислоты

V* \

(тип С=01. Такое превращение необычно для классической органической

Химия коферментов

463

химии. Оно объясняется тем, что сера в тиоэфире может использовать при образовании связей свои вакантные орбитали *.

|СН3„

СООН

тиополуацетальный интермеоиат

¦липоевая кислота (коеалент'но присо-еЗинена к субъеЭинице

[ фермента)

рр

ацетиллипоамиЭ сн3—с (тиоэфир) ? SH

соон

'н

I * Синтондитиан — один из ближайших органических аналогов, в котором коединение типа ^,С=0 превращается в соединение типа ^,С=0

^ HS—/ н

Н'

° о

В органической химии известны и другие аналогичные примеры: mun RCfJ тип RCQ

R-C-OSi(CH3)3 -^ R-C^

CN °

Н—СС13

сн3—с—соон 9

НгО NaI04

н—СООН

> CHj-COQH

464

Глава 7

При рассмотрении механизма действия липоевой кислоты следует упомянуть о соединениях мышьяка — древнейших, хорошо известных ядах. Совсем недавно органические соединения мышьяка стали использоваться как фунгициды и инсектициды. Наибольшее значение как токсичные вещества имеют соединения трехвалентного мышьяка Например, арсенит (0=As—О-) известен своей тенденцией быстро реагировать с тиольными группами, и особенно с ди-тиолами, такими, как восстановленная липоевая кислота. В результате, блокируя окислительные ферменты, которые нуждаются в липоевой кислоте, арсенит вызывает накопление пирувата и других а-кетокислот.

РР

Рис. 7.12. Аналогия между цианид-ионом и тиазолий-ионом в тиамин-РР.

Описанные выше превращения тиамина ясно показывают аналогию тиамина с цианид-ионом, поскольку образующийся анион сравнительно устойчив благодаря частичной делокализации отрицательного заряда атомами углерода и азота (рис. 7.12). Поскольку атом азота в тиазолиевом кольце уже имеет положительный заряд, то он, по-видимому, еще в большей степени, чем цианид-ион, стабилизирует отрицательный заряд. По этой причине его можно назвать «биологическим цианидом» [301].

Кроме того, аддуктьг, образующиеся между тиамин-РР и субстратами, можно сравнить с Р-кетокислотами и Р-кетоспиртами, которые легко подвергаются Р-расщеплению:

Химия коферментов

465

щ3.1. Конструирование моделей тиамина

(Имеются сообщения о создании лишь нескольких биомоделей шамина, в числе которых N-бензилтиазолий-ион. При рН 8,0 и 5°С он легко может декарбоксилировать пировиноградную кис-Ягу и модифицировать другие субстраты:

ти реакции подчеркивают роль активной части тиамина как кон-^нсирующего агента.

j При изучении других тиазолиевых соединений, участвующих в катализе ацетоиновой конденсации, было обнаружено, что блокирование положения 2 объемистым заместителем (изопропилом) или введение метильной группы в это положение лишает тиазолие-шую соль каталитических свойств [328].

сн2ч<8

сн.

Н' S активное соединение

СН3

СН

О-сн СНз неактивное соеЭинение

?СН,

Ху

н-'чз' Н' XS'

неактивное соеЭинение активное соеачнение

СН3 ф /ITT

XS

Кроме того, большая эффективность катализа в случае N-бен-вилового аналога по сравнению с N-метиловым аналогом заставила рреслоу предположить, что бензильная группа благодаря индуктивному эффекту увеличивает активность катализатора. Аналогичная роль постулируется для пиримидинового кольца тиамина,

466

Глава 7

Вот другая интересная модель:

АС= -бЗкДж/моль И5 ккал/моль)

Здесь тиаминовый аналог, являясь хорошей уходящей группой, ведет себя как «высокоэнергетический» ацилирующий агент [327].

Недавно с помощью другого подхода была исследована активность полученных из тиазолиевых солей ациланионных соединений (биологический «активный альдегид») по отношению к содержащим серу электрофилам. При этом была построена модель стадии образования тиоэфиров, катализируемой содержащими липоевую кислоту ферментами. Результаты заставляют предполагать, что биологический синтез тиоэфиров кофермента А из ос-кетокислот происходит путем прямого восстановительного ацилирования связанной с ферментом липоевой кислоты «активным альдегидом» (разд. 7.3).

Чтобы определить химическую основу связывающей способности тиаминзависимых ферментов, была изучена [337] реакция тиамин-РР и метилацетилфосфоната в водном растворе карбоната натрия. Этот субстрат — аналог пировиноградной кислоты — связывается с пируватдегидрогеназой, но не может участвовать во всех многостадийных ферментативных процессах.

о о R>. <в гн

II И/Ое Ч1^СНэ

сн,-с-р^ + X X »=*

осн3 H-^S^CjH^O,36 R

он\® >сн. снД-Ci о=р

i осн3 е

В самом деле, фосфатный аддукт напоминает активное промежуточное соединение сс-лактил-ТРР (см. обычный процесс в

Химия коферментов

467

[разд. 7.3), но реакция не может идти дальше, поскольку уходящей Группой должен был бы стать метилметафосфат, а это, естественно, подразумевает преодоление большого энергетического барьера [[337]. Кроме того, в процессе реакции возникает хиральный центр, и образующийся аддукт представляет собой рацемическую смесь. Кинетические данные показали, что оба энантиомера связываются Ь апоферментом, но при этом только один из них превращается Ьпять в тиамин-РР, хотя, конечно, его истинная конфигурация не известна. Этот пример иллюстрирует возрастающее значение для Ьиоорганической химии теории образования генерируемых ферментом активных «аналогов переходного состояния».

Т Весьма вероятно, [301], что в результате химической эволюции |тиамин-РР должен был структурно «приспособиться» к своей биологической роли. Например, алкилированно