удобен резазурин, который добавляют к средам в концентрации 0,0001% и стерилизуют вместе с минеральными компонентами среды. В окисленной форме он окрашен в голубой цвет, при восстановлении цвет меняется на слабо-розовый, полностью восстановленная форма бесцветна. Ре-зазурин изменяет окрраску при значениях ОВП, близких к—420' мВ, феносафранин — в области —252 мВ.

Для культивирования анаэробов предложены специальные камеры и система ГазПак (GasPak), образующая газы (водород и С02) в замкнутом пространстве и эффективно поглощающая кислород. В качестве поглотителя кислорода в лабораторной практике используют щелочной раствор пирогаллола, дитионита натрия, металлическое железо и некоторые другие реактивы. При этом необходимо учитывать поглощающую способность реактивов и объем замкнутого пространства, в котором выращивают микроорганизм. Например, на каждые 100 мл емкости используют 1 г пирогаллола и 10 мл 2,5 н. раствора гидрокоида натрия. Поскольку многие анаэробы нуждаются в углекислоте, пирогаллол часто растворяют не в щелочи, а в насыщенном растворе бикарбоната цатрия. Полноту поглощения кислорода контролируют раствором, содержащим окислительно-восстановительный индикатор. Для приготовления раствора смешивают равные объемы 0,024%-ного NaOH, 0,015%-ного водного метиленового синего и 6%-ной глюкозы; в качестве антисептика к раствору добавляют тимол. Перед использованием в пробирку наливают 5 мл смеси и нагревают на кипящей водяной бане до обесцвечивания, быстро охлаждают и помещают в анаэростат. В анаэробных условиях раствор остается бесцветным.

В качестве восстановителя чаще всего используют сульфид и тиогликолат натрия. Обычно готовят 1%-ные растворы этих восстановителей в 5%-ном растворе бикарбоната натрия, стерилизуют автоклавированием и добавляют к средам сульфид натрия ш расчета 250—500 мг/л, а тиогликолат — до 250 мг/л среды. Восстановители используют в концентрациях, не влияющих иа рост микроорганизмов.

Для культивирования строгих анаэробов предложены специальные камеры, заполненные газовыми смесями (чаще всего 90%' N2, 5% С02 и 5% Н2), которые содержат внутри все необходимое для выполнения микробиологических работ, включая термостат. Это оборудование сложно и дорого, но оно имеет одно неоспоримое преимущество — контакт клеток с кислородом воздуха остается минимальным почти на всех этапах работы.

4.2.3. Температура

Интервалы температур, в которых возможен рост различных микроорганизмов, заметно варьируются. У мезофилов, к которым относится большинство известных нам форм, температурный оптимум лежит в интервале от 25 до 37°. У термофилов он значительно выше — от 45 до "80—90°. Психрофилы хорошо развиваются в интервале температур 5—10°. Отклонения температуры от оптимальной неблагоприятно влияют на развитие микроорганизмов. Поэтому микроорганизмы выращивают в термостатах или специальных термостатированных комнатах, где с помощью терморегуляторов поддерживается соответствующая оптимальная температура. Мезофильные бактерии, естественным местом обитания которых являются вода и почва, выращивают в интервале от 20 до 30°, тогда как бактерии кожных покровов, слизистой или кишечника человека и животных культивируют при более высокой температуре — 35—37°.

Для выращивания психрофилов используют холодильные камеры.

4.2.4. Свет

Для роста подавляющею большинства микроорганизмов освещение не требуется. Напротив, прямые солнечные лучи отрицательно влияют на их развитие. Поэтому такие микроорганизмы выращивают в темноте. Свет необходим для роста фототрофных микроорганизмов. Однако естественное освещение используют редко, так как оно непостоянно и плохо контролируемо. Как правило,, фототрофов выращивают в люминостатах, т. е. в камерах, освещенных лампами накаливания или флуоресцентными лампами дневного света. Необходимая температура в люминостатах создается благодаря вентиляции или холодильному устройству.

Выбор источника освещения определяется спектром его излучения и длинами волн, при которых осуществляют фотосинтез культивируемые микроорганизмы. Для выращивания пурпурных и зеленых бактерий лучше использовать лампы накаливания; для культивирования цианобактерий и микроводорослей можно применять флуоресцентные лампы дневного света. Помимо спектрального .состава света обращают внимание на освещенность, которую измеряют с помощью люксметра.

4.2.5. Вода

Рост микроорганизмов невозможен без присутствия в окружающей среде воды, причем вода должна находиться в доступной для клетки форме, т. е. жидкой фазе. Однако в природных субстратах и питательных средах часть воды ассоциирована с молекулами растворенных веществ и не может быть использована микроорганизмами. Доступность воды в субстрате для роста микроорганизмов выражают величиной активности воды (aw):

Р

где Р — давление пара раствора (мм рт. ст.); Р0 — давление пара чистой воды (мм рт. ст.) при данной температуре. Значение аю для дистиллированной воды равно 1,00. При растворении различных веществ в воде эта величина уменьшается и соответственно падает доступность для клетки воды.

Микроорганизмы могут расти на средах со значением aw от 0,99 до 0,63. Потребности в доступной воде у бактерий, как правило, выше, чем у дрожжей и мицелиальных грибов. Так, большинство бактерий, за исключением галофилов, хорошо растут на средах с величиной aw от 0,99 до 0,95, минимальная величина aw, обеспечивающая рост дрожжей, лежит в пределах от 0,91 до 0,88.

Активность воды в среде можно определить по формуле аш=Л/100, где Л — относительная влажность (%) атмосферы, которую измеряют при равновесии в закрытом сосуде, содержащем среду. Различную активность воды в питательной среде или субстрате создают добавлением к ним таких соединений, как NaCl, КС1, глюкоза, глицерин, полиэтиленгликоль.

4.2.6. Периодическое и непрерывное культивирование

Существуют две принципиально разные системы выращивания микроорганизмов в жидкой среде. В одном случае после инокуляции среды не происходит ни добавления в нее, ни удаления каких-либо компонентов, кроме газовой фазы. Такая закрытая система культивирования носит название периодической и может поддерживать размножение клеток только в течение ограниченного времени, на протяжении которого меняется состав исходной среды и окружающие условия.

Непрерывное (проточное) культивирование в отличие от периодического характеризуется постоянной подачей питательной среды со скоростью, равной скорости удаления культуры. При этом объем культуры в ферментере во времени не меняется. Одно из основных условий непрерывного культивирования — хорошее перемешивание культуры в ферментере. Система непрерывного культивирования может быть реализована по принципу турбидо-стата или хемостата. Турбидостат — наиболее простой режим проточного культивирования, концентрация клеток в нем выбирается исследователем, а поступление питательных компонентов автоматически реализуется в соответствии с плотностью популяции. Меняя скорость подачи питательной среды («скорость разбавления»), экспериментатор может получать разные значения скорости роста популяции — от близких к нулю до максимальной, таким образом воспроизводя разные состояния культуры от стационарной фазы до стадии .экспоненциального роста.

Для непрерывного культивирования микроорганизмов может быть использован слегка модифицированный ферментер, применяемый при периодическом культивировании (рис. 37). В первом случае требуется система двойного насоса (для добавления свежей среды и удаления культуральной жидкости), используемая вместе с регулятором уровня среды; при этом культуральная жидкость удаляется через отверстия для отбора проб. Такие насосы необходимы при проточном культивировании в больших емкостях. В малых ферментерах удаление жидкости может происходить через боковую отводную трубку, расположенную на уровне, позволяющем поддерживать определенный объем культуры. Малые ферментеры с боковым отводом жидкости можно изготовить из стандартных стеклянных или стальных сосудов.

4.3. ХРАНЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

Необходимым условием успешной работы с микроорганизмами является правильное поддержание их с целью сохранения не только жизнеспособности клеток, но и таксономических, а также любых других, важных для исследователя .свойств. Общего метода, одинаково пригодного для хранения многочисленных и разнообразных групп микроорганизмов, пока не существует. Поэтому в крупных коллекциях разные группы микроорганизмов сохраняются различными методами. Кроме того, чтобы исключить возможность потери микроорганизма, каждый штамм сохраняется не одним, а несколькими способами.

К числу наиболее распространенных способов хранения микроорганизмов относятся периодические пересевы на свежие питательные среды, сохранение культур на питательной среде под вазелиновым маслом, хранение клеток в лиофилизированном состоянии. Значительно реже микроорганизмы сохраняют при низких или сверхнизких температурах, в дистиллированной воде или 1%-ном растворе хлористого натрия, на адсорбентах в высушенном состоянии. Выбор метода хранения во многом зависит от целей, для которых используются микроорганизмы, а также от имеющегося в распоряжении исследователя оборудования.

Периодические пересевы на питательные среды. Этот способ

был одним из первых приемов длительного сохранения микроорганизмов в лабораторных условиях и до настоящего времени широко используется в практике микробиологических работ. Аэробные микроорганизмы пересевают чаще всего на поверхность скошенной агаризованной среды, микроаэрофилы — в полужидкую среду, содержащую 0,2—0,3% агара, анаэробы — в толщу плотной среды или в жидкую среду. Культуры пересевают на свежие среды в 2 пробирки (колбы). В дальнейшем из одной пробирки микроорганизмы используют для работы, культуру во второй пробирке оставляют дли сохранения и последующего пересева.

Частота пересева на свежую среду различных микроорганизмов неодинакова и в большой степени определяется их свойствами. Многие микроорганизмы можно пересевать один раз в 1—2 месяца, хотя есть микроорганизмы, например молочнокислые бактерии,