Биологический каталог




Руководство к практическим занятиям по микробиологии

Автор М.Н.Пименова, Н.Н.Гречушкина, Л.Г.Азова, А.И.Нетрусов и др.

микроорганизмы на мясо-пептонном агаре не развиваются. Следует иметь в виду, что заключение о чистоте некоторых культур микроорганизмов нельзя сделать только по результатам высева на МПА. Особенно это касается автотрофных микроорганизмов, а также представителей гетеротрофов, склонных развиваться с одним или несколькими спутниками. Чистоту таких культур микроорганизмов проверяют высевом еще на ряд сред — сусло, мясо-пептон-ный бульон, картофельный агар и др. Набор сред и их состав определяются особенностями метаболизма выделенных микроорганизмов, а также их возможных спутников.

ГЛАВА 6

МОРФОЛОГИЯ и ЦИТОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

6 1. микроскопия

Изучение морфологии и строения клеток микроорганизмов, величина которых измеряется в большинстве случаев микрометрами (мкм=0,001 мм=10~6 м), возможно только с помощью микроскопов, обеспечивающих увеличение исследуемых объектов в сотни (световая микроскопия) и десятки тысяч (электронная микроскопия) раз. Изображение в световом микроскопе формируется вследствие того, что объект и различные элементы его структуры избирательно поглощают свет с различной длиной волны (абсорбционный контраст) или вследствие изменения фазы световой волны при прохождении света через объект (фазовый контраст). Световая микроскопия включает обычную просвечивающую микроскопию (светло- и темнопольную), фазово-кон-трастную и люминесцентную.

6.1.1. Светлопольная микроскопия

Существуют различные модели учебных и исследовательских световых микроскопов. Внешний вид и принципиальное устройство одного из них (микроскоп биологический рабочий, МБР-1) приведены на рисунке 43. Подобные микроскопы позволяют определить форму клеток микроорганизмов, их размер, подвижность, степень морфологической гетерогенности, а также характерную для микроорганизмов способность к дифференцирующему окрашиванию. Рассмотрим некоторые особенности оптической системы светового микроскопа на примере МБР-1, так как от знания их зависит успех наблюдения объекта и надежность получаемых результатов.

Оптическая часть микроскопа включает осветительный аппарат,

объектив и окуляр.

Осветительный аппарат состоит из зеркала и конденсора и предназначен для наилучшего освещения препарата. Регулируемое зеркало укреплено у основания штатива и имеет две стороны: вогнутую и плоскую. Вогнутое зеркало собирает и концентрирует в плоскости препарата пучок лучей, идущих от источника света, поэтому им пользуются только в тех случаях, когда работают без конденсора, т. е. с очень малыми увеличениями. При работе с конденсором, который рассчитан на использование

13

Рис. 43. Микроскоп МБР-1: 1 — подковообразное основание микроскопа; 2 — предметный столик; 3 — винты для перемещения предметного столика; 4 — клеммы, прижимающие препарат; 5 — конденсор; 6 — кронштейн конденсора; 7 — винт, укрепляющий конденсор в гильзе; 8 — рукоятка перемещения конденсора; 9 — рукоятка ирисовой диафрагмы конденсора; 10 — зеркало; 11 — тубусо-держагель; 12 — рукоятка макрометрического винта; 13 — рукоятка микрометрического винта; 14 — револьвер; 15 — объективы; 16 — наклонный тубус; 17 — виит для крепления тубуса; 18 — окуляр

параллельных лучей, следует пользоваться только плоской сторо* ной зеркала. Конденсор, укрепленный непосредственно над зеркалом, состоит из нескольких линз и предназначен для собирания параллельных лучей света, идущих от источника света и отраженных плоским зеркалом, в одной точке — фокусе, который должен находиться в плоскости препарата. В конденсор вмонтирована ирисовая (апертурная) диафрагма, позволяющая задерживать излишние лучи света и регулировать апертуру (см. ниже) конденсора. Под конденсором находится откидная оправа для светофильтра.

Объектив представляет собой наиболее важную часть микроскопа. Он дает действительное увеличенное и обратное изображение изучаемого объекта. Объектив состоит из системы линз, заключенных в металлическую оправу. Самая главная — наружная (фронтальная) линза, от фокусного расстояния которой зависит увеличение объектива. Чем больше кривизна фронтальной линзы, тем короче фокусное расстояние и тем больше увеличение объектива. Увеличение объектива всегда обозначено на его оправе. От увеличения объектива зависят еще две его характеристики — рабочее расстояние, т. е. расстояние от фронтальной линзы до плоскости препарата при сфокусированном объекте, и площадь поля зрения. Чем больше увеличение объектива, тем меньше его рабочее расстояние и поле зрения (табл. .10).

Таблица 10

Оптические данные объективов микроскопа МБР-1

Система Собственное увеличение Числовая апертура Фокусное расстояние, мм Свободное рабочее расстояние, мм

Сухая 8Х 0,20 18,2 8,53

Сухая 40Х 0,65 4,3 0,40

Масляная иммерсия 90Х 1,25 1,9 0,10

Микроскопы имеют сухие объективы для наблюдения живых микроорганизмов, а также для поиска нужного поля зрения, дающие увеличение в 8 (10) и 40 раз, и иммерсионные, увеличивающие объект в 90 (100 раз) и позволяющие провести более детальное изучение формы и строения микроорганизмов.

Окуляр содержит две линзы — глазную (верхнюю) и собирательную и служит для рассмотрения изображения предмета» даваемого объективом, т. е. выполняют роль лупы. Окуляры могут давать увеличение в 5, 7, 10, 12, 15 и 20 раз, что указано на их оправе, например 15Х- Общее увеличение окуляра повышается с уменьшением фокусного расстояния линз, его составляющих» поэтому более сильные окуляры будут короткими, а более слабые — длинными.

Увеличение, которое дает микроскоп, определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. Так, например, использование окуляра 15Х и объектива 90Х позволяет увеличить объект в 1350 раз. Однако общее увеличение еще не характеризует всех возможностей микроскопа. Увеличенное изображение может оказаться как четким, так и нечетким.

Отчетливость получаемого изображения определяется разре* шающей способностью микроскопа, которая зависит от длины волны используемого света и числовой апертуры оптической системы микроскопа. Разрешающая способность связана обратной связью с пределом разрешения — минимальным расстоянием между двумя точками, при котором еще можно различить каждую из них. Предел разрешения определяется следующим образом:

А

где d — минимальное расстояние между двумя точками; Av — числовая апертура объектива; А2 — числовая апертура конденсора; А, — длина волны используемого света. Числовая апертура определяется произведением синуса половины (и) отверстного угла (а) на показатель преломления (п) среды, граничащей с линзой (рис. 44): Л—я-sina. Иными словами, числовая апертура — это оптический «охват» линзы, она является мерой количества света, попадающего в линзу. Использование объективов с большой апертурой и коротковолнового света позволяет увидеть структурную организацию клетки и даже крупные вирусы.

Числовая апертура любой линзы, граничащей с воздухом, не может быть больше 1, так как показатель преломления воздуха равен 1, а угол и (см. рис. 44) не может быть больше 90° (т. е. sinw^l). В микроскопе МБР-1 объектив 40Х имеет апертуру 0,65, а конденсор — примерно 1. Таким образом, при использовании объектива 40Х и зеленого света с длиной волны 550 нм (0,55 мкм) предел разрешения составляет 0,33 мкм. Повысить разрешающую способность можно двумя путями: либо освещать объект более короткими лучами света, например ультрафиолетом, что требует применения дорогостоящей кварцевой оптики, либо увеличивать показатель преломления среды, граничащей с линзой, с тем, чтобы приблизить его к показателю преломления стекла, на котором находится объект (п стекла =1,5). Для этого между фронтальной линзой объектива и исследуемым объектом помещают каплю жидкости с показателем преломления большим, чем показатель преломления воздуха, например, каплю воды (п = 1,3), глицерина (п — 1,4) или кедрового (иммерсионного) масла {п = 1,5). Для каждой Рис. 44. Схема хода лучей при разной указанной жидкости выпускают

величине угла а: специальные объективы, которые

А — объект; О — объектив; а — от- „ I „. г „

верстный угол; и ~ половина отвер- называются иммерсионными.

стного угла Числовая апертура этих ооъектиBOB возрастает благодаря увеличению как значения п, так и sin и (рис. 45).

Числовая апертура объектива указана на его оправе. Объективы микроскопа МБР — 18х и 40Х имеют апептуру соответственно 0,20 и 0,65. У масляного иммерсионного объектива с увеличением 90Х апертура 1,25. На оправе этого объектива нанесено также обозначение «МИ» —• масляная иммерсия — и черное кольцо. На оправе объектива водной иммерсии имеется обозначение «ВИ» — водная иммерсия —

и белое кольцо. Этот объектив увеличивает в 70 раз (70Х)' и имеет апертуру 1,23.

Апертура конденсора должна соответствовать числовой апертуре объектива. Когда она меньше апертуры объектива, оптические возможности линзы последнего не будут использованы полностью из-за слабости попадающего в нее светового потока. Если апертура конденсора больше апертуры объектива (что, в частности, бывает при работе с сухими системами), то необходимо несколько прикрыть ирисовую диафрагму конденсора. Это приведет к устранению рассеянного света и даст нужную контрастность изображения (рис. 46). Неиммергированный конденсор микроскопа

МБР-1 имеет апертуру не более 0,95. Помещая иммерсионное масло между верхней линзой конденсора и нижней поверхностью предметного стекла, повышают апертуру конденсора до 1,2.

В работе со световым микроскопом следует помнить, что четкое изображение получается при хорошем освещении; однако диафрагмирование конденсора дает эффект контрастирования живых объектов. Препарат должен быть частью однородной оптической системы, что достигается заливкой объекта водой, маслом или другой подходящей жидкостью. В случае необходимости наблюдения объекта через дно чашки Петри лучше использовать вогнутое зеркало, устраняя эффекты искажения, вызванные неровностью поверхности чашки, с помощью капли иммерсионного масла, накрытой покровным стеклом.

ПОРЯДОК РАБОТЫ СО СВЕТЛОПОЛЬНЫМ МИКРОСКОПОМ

с микроскопом могут быть получены тол

страница 17
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46

Скачать книгу "Руководство к практическим занятиям по микробиологии" (2.03Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.09.2019)