при которой их выращивали. Прежде чем делать мазок, каплю полученной суспензии просматривают под микроскопом и убеждаются в том, что клетки подвижны и плотность суспензии невелика — 5—10 клеток в поле зрения.

Клетки легко теряют жгутики в момент приготовления мазка, поэтому необходимо обращать внимание на чистоту стекла и способ нанесения на него суспензии. Предметные стекла должны быть тщательно обезжирены. Непосредственно перед приготовлением мазка стекло 3—4 раза проводят через наиболее горячую часть пламени горелки. Дают стеклу остыть и пастеровской пипеткой или петлей наносят 3—4 маленькие капли на стекло. Капли должны хорошо расплываться по стеклу и быстро высыхать. Высушенный мазок заливают протравой. Необходимо следить, чтобы протрава не подсыхала. Через 15 мин протраву смывают дистиллированной водой и препарат окрашивают в течение 5 мин разбавленным фуксином Циля, погружая его мазком вниз в раствор красителя. Затем препарат промывают водой, высушивают на воздухе и исследуют с иммерсионной системой. Обращают внимание на расположение жгутиков, их количество и длину.

По методу Рыжковой препарат заливают протравой через воронку с фильтром и трижды в течение 3—5 мин подносят стекло к пламени горелки до появления паров. Затем протраву сливают и препарат заливают через воронку с фильтром раствором Циля на 5—10 мин

Окраска жгутиков по способу Фонтана. Для окраски жгутиков используют клетки 12—16-часовой культуры, выращенной на скошенной агаризованной среде с конденсационной водой. Культуру вынимают из термостата и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. В пробирку с 0,5 мл водопроводной стерильной воды вносят клетки, взятые на границе с конденсационной водой. Материал берут осторожно, следует только коснуться бактериологической петлей поверхности культуры. Петлю с бактериальной массой оставляют в воде на 1 ч. За это время подвижные бактерии окажутся свободно взвешенными в воде. Затем петлю вынимают, прокаливают, охлаждают и только после этого ею берут капли взвеси бактерий и осторожно наносят их на обезжиренное стекло. Нанесенные капли не размазывают, они должны быстро высохнуть, лучше в термостате. Мазки фиксируют 5 мин жидкостью Руге. Препарат промывают водой, заливают протравой и подогревают стекло до появления паров в течение

2 мин. Протраву сливают и препарат тщательно промывают водой. Далее обработку препарата проводят серебрением. Разбавленный аммиачный раствор серебра наливают на мазок и стекло несколько раз осторожно подогревают в течение 2 мин до появления паров. Препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. Бактерии в препарате окрашены в черный или темно-коричневый цвет, а жгутики, часто спутанные, — в светло-коричневый или желтый.

Нуклеоид. Обнаружить нуклеоид в бактериальной клетке при помощи светового микроскопа трудно. Основные красители, избирательно окрашивающие хроматин ядер эукариотических клеток, равномерно и интенсивно окрашивают всю прокариотную клетку. Для избирательного окрашивания нуклеоида фиксированные клетки предварительно обрабатывают рибонуклеазой или разбавленной соляной кислотой, чтобы разрушить рибосомальную РНК-Последующее окрашивание основным красителем позволяет выявить нуклеоид в виде плотных тел, имеющих неправильные очертания и расположенных в центре или на обоих полюсах клетки. Довольно четко нуклеоид обнаруживается у следующих бактерий: Proteus vulgaris, Azofobacter chroococcum, Bacillus megaterium. Bacillus mycoides, Bacillus subtilis.

Для выявления нуклеоида поступают следующим образом. На предметном стекле делают мазок суточной культуры бактерий, высушивают его на воздухе и фиксируют в течение 2—3 мин в парах 2%-ного раствора осмиевой кислоты. С этой целью на дно чашки Петри наносят 2-—3 капли фиксатора, а предметное стекло помещают мазком вниз на обрезки стекла. По окончании фиксации препарат опускают на 2—3 мин в стаканчик с раствором 1 н. НС1 для гидролиза рибосомальной РНК. Стакан держат на водяной бане при 60°. После гидролиза препарат немедленно промывают водой. Затем мазок помещают на 15 мин в 1%-ный раствор формалина, вновь промывают водой и окрашивают в течение 1—2 мин 0,1—1,0%-ным водным раствором основного фуксина. Препарат промывают, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. Цитоплазма окрашивается в розовый цвет, нуклеоид — в ярко-малиновый.

Многие микроорганизмы в определенных условиях образуют запасные вещества, которые обнаруживаются в клетке в виде гранулярных цитоплазматических включений. Природа запасных веществ различна. Чаще всего это полисахариды, липиды, полифосфаты. Некоторые бактерии накапливают в клетках серу.

Гранулы углеводной природы (полисахариды) выявляют при

обработке клеток раствором Люголя. Для этого к капле суспензии клеток на предметном стекле добавляют каплю раствора Люголя. Препарат накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Гранулы крахмалоподобных веществ — гранулезы — окрашиваются в синий, а гранулы гликогеноподобных полисахаридов — в красновато-коричневый цвет. Гликоген при окраске Люголем легко выявляется у дрожжей, гранулеза характерна для бактерий рода Clostridium. Реакция на гликоген хорошо идет только в кислой среде, поэтому перед выявлением в клетках гликогена среду, в которой выращивали микроорганизмы, подкисляют.

Липидные гранулы. У дрожжей и мицелиальных грибов запасные липиды представлены нейтральными жирами, которые легко обнаруживаются в живых клетках без специальных методов окраски в виде сильно преломляющих свет капель. Бактерии в качестве резервных липидов образуют поли-^-оксимасляную кислоту. Гранулы поли-р-оксибутирата хорошо заметны при микроскопи-ровании живых бактериальных клеток с фазово-контрастным устройством, однако чаще для их выявления клетки окрашивают ли-пофильными красителями — Суданом III или Суданом черным. Готовят тонкий мазок клеток, высушивают его на воздухе и фиксируют в пламени горелки. Заливают поверхность мазка раствором Судана черного и оставляют краситель на 5—15 мин. Избыток красителя сливают, просушивают препарат фильтровальной бумагой, просветляют в ксилоле, погружая в него несколько раз предметное стекло. Время просветления препарата не должно превышать 1 мин. После этого клетки дополнительно окрашивают в течение 10 с 0,1%-ным водным раствором сафранина. Более длительная обработка сафранином нежелательна, так как маскируется основная окраска. Гранулы поли-^-оксибутирата окрашиваются в темный цвет, остальная часть клетки — в розовый.

Полифосфаты (син. волютин и метахроматин). В клетках прокариот волютин локализован в цитоплазме, в клетках эукариот — в вакуолях. Окраска волютиновых гранул основана на свойстве метахромазии — способности вызывать изменение цвета некоторых красителей (метиленовый синий, толуидиновый синий). Готовят тонкий мазок клеток, высушивают его на воздухе и фиксируют в пламени горелки. На фиксированный мазок наливают метиленовый синий по Леффлеру и окрашивают клетки в течение 10 мин Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. Клетки окрашиваются в голубой цвет, а зерна волютина — в фиолетово-красный. Волютин легко выявить окраской по способу Омелянского, основанному на плохой растворимости волютина в растворах кислот. В этом случае на фиксированный в пламени горелки мазок наливают карболовый фуксин Циля и окрашивают клетки в течение 0,5—1,0 мин. Краску сливают, промывают препарат водой и обесцвечивают 1 % -ным раствором H2S04 в течение 20—30 с. Затем кислоту сливают, препарат промывают водой и дополнительно окрашивают 20—30 с метиленовым синим (1:40) Снова промывают препарат водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. При правильном окрашивании гранулы волютина имеют красный цвет и хорошо видны на фоне синей цитоплазмы

Для выявления волютина у дрожжей применяют следующий способ. Фиксированный в пламени горелки мазок окрашивают метиленовым синим по Леффлеру в течение 3 мин. Краситель сливают, препарат промывают водой и, не высушивая, наносят на мазок небольшую каплю 1%-ного раствора серной (кислоты; мазок накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Волютин имеет вид капель сине-фиолетового цвета па слабо-голубом фоне цитоплазмы.

Включения серы встречаются только у некоторых бактерий. Благодаря двойному лучепреломлению капли серы хорошо заметны в клетках без специального окрашивания. Включения серы растворяются при обработке клеток абсолютным спиртом, сероуглеродом или ледяной уксусной кислотой.

Параспоральные тельца. Спорулирующая клетка Bacillus thu-ringiensis образует примыкающий к споре правильный бипирами-дальный белковый кристалл, который высвобождается вместе со спорой при автолизе материнской клетки. Для обнаружения па-распоральных телец применяют специальную окраску. Готовят тонкий мазок клеток, высушивают его на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и в течение 2 мин окрашивают анилиновым черным. Затем осторожно смывают краску водой и мазок в течение 15 с докрашивают фуксином Циля. Препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. При правильной окраске кристаллы белка (параспоральные тельца) окрашиваются в черный, а остальная часть клетки — в розовый цвет. Параспоральные тельца можно наблюдать и в живых клетках, используя фазово-контрастное устройство. В этом случае параспоральные тельца выглядят как гранулы, способные сильно преломлять свет.

6.2.5. Эндоспоры

Эндоспоры образуют бактерии родов Bacillus, Clostridium и некоторых других. Для обнаружения способности клеток к спорообразованию лучше использовать старые культуры. Споры можно обнаружить при наблюдении живых клеток, а также путем дифференциального окрашивания цитоплазмы и споры. В случае выявления у микроорганизма способности к образованию спор необходимо обратить внимание на тип спорообразования (бациллярный, клостридиальный, плектридиальный), расположение споры в клетке (центральное, эксцентральное или полярное), форму свободных спор (круглая, овальная или продолговатая) и определить их размеры. С этой цел