Биологический каталог




Руководство к практическим занятиям по микробиологии

Автор М.Н.Пименова, Н.Н.Гречушкина, Л.Г.Азова, А.И.Нетрусов и др.

ью просматривают клетки 2—3-суточ-ной культуры, так как большинство спорообразующих бактерий проходят за этот период времени все стадии развития—-от вегетативной клетки до» свободной споры.

Наблюдение спорообразования в микрокультуре. На стерильном предметном стекле, как описано выше (см. 6.2.1.), получают тонкую пленку агаризованной питательной среды, благоприятной для спорообразования (например, картофельного агара). В центр

ПО

пленки наносят петлей каплю жидкой 24-часовой культуры Bacillus megaterium или другой крупной спорообразующей бактерии» Полученный препарат инкубируют при 37° во влажной камере к течение 20—24 ч. Перед микроскопированием препарат подкрашивают метиленовым синим по Леффлеру и осторожно накладывают покровное стекло. Микроскопируют с иммерсией или фазовым контрастом. Просматривают край колонии, обращая внимание на расположение клеток и на клетки в разных стадиях спорообразования.

Наблюдение живых клеток. Споры по сравнению с цитоплазмой характеризуются более высоким показателем преломления: света, поэтому при микроскопировании в светлом поле они видны как более темные включения округлой или овальной формы. При использовании фазово-контрастного устройства споры имеют вид, светлых включений на фоне почти черных клеток.

Метод выявления спор негативным окрашиванием. На предметном стекле готовят тонкий мазок клеток спорулирующих бак-терий, подсушивают на воздухе и фиксируют в пламени. Затем на-3—5 мин наносят метиленовый синий или на 1—3 мин фуксин,, после чего препарат осторожно промывают водой и подсушивают на воздухе. Просматривают с иммерсией.

Вегетативные клетки бактерий прокрашиваются, а споры„ имеющие многослойную, труднопроницаемую оболочку — нет. Они видны как сильно преломляющие свет сферические шш овальные образования, находящиеся в зависимости от стадии спорообразования внутри или вне клеток бактерий.

Метод удобен при количественной оценке процесса спорообразования путем подсчета количества спор и вегетативных клеток в разных условиях роста бактерий.

Дифференциальная окраска споры и цитоплазмы по методу

Пешкова. Споры и цитоплазму окрашивают при нагревании. Промывание препарата водой ведет к обесцвечиванию цитоплазмы^ тогда как спора прочно удерживает краситель.

На обезжиренном предметном стекле готовят мазок, высушивают его на воздухе, фиксируют в пламени горелки и заливают раствором метиленового синего по Леффлеру. Краситель доводят до кипения, держа предметное стекло над пламенем горелки. Па мере испарения красителя добавляют новые его порции. Продолжительность окраски, считая с момента закипания красителя,— 10—20 с. Затем предметное стекло охлаждают, препарат тщательно промывают водой, после чего клетки в течение 30 с докрашивают 0,5%-ным водным раствором нейтрального красного или сафранина. Краситель сливают, препарат промывают водой и просматривают с иммерсионной системой. При правильном окрашивании клетки имеют красный, а споры — синий цвет. Вместо метиленового синего можно использовать малахитовый зеленый. В этом случае препарат, фиксированный в пламени горелки, заливают на 7—10 мин 7,5%-ным раствором малахитового зеленого.

Окрашивание проводят с подогревом, помещая препарат над сосудом с кипящей водой или над пламенем горелки. По окончании окраски предметное стекло охлаждают, промывают препарат водой и докрашивают клетки 0,25%-ным водным раствором сафранина в течение 1—2 мин. Споры окрашиваются в зеленый цвет, клетки — в розовый.

6 3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ

Как уже отмечалось (6.1.4), некоторые микроорганизмы обладают собственной (первичной) люминесценцией, что связано с наличием в их клетках люминесцирующих веществ — хлорофилла, каротиноидов, рибофлавина, алкалоидов, порфиринов, некоторых антибиотиков. Такие микроорганизмы можно изучать в люминесцентном микроскопе на препаратах «раздавленная капля». Однако в большинстве случаев применяется предварительная обработка клеток специальными красителями — флуорохромами, что приводит к вторичной люминесценции. Существуют природные и синтетические флуорохромы. Широко используются акридин оранжевый, этидиумбромид, примулин, родамин, бербер инсульфат, флуорескамин, аурофосфин и некоторые другие, избирательно концентрирующиеся на отдельных структурах клетки. Флуореска-мин выявляет аминогруппы, этидиумбромид—ДНК, фосфин 3R— липиды. Калькофлуор белый образует соединения с хитином, целлюлозой и используется для учета грибов в почве. Диацетилфлуо-ресцеин дифференцирует живые и мертвые клетки.

Особый интерес представляет флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ), образующий связь с белками антител без нарушения их способности соединяться с гомологичными антигенами. Меченные ФИТЦ антитела представляют собой высокочувствительные индикаторы на соответствующие антигены. Антитела получают общепринятыми методами из крови иммунизированных кроликов и затем флуорохромируют. Кроме того, широко используются готовые, меченные флуорохромом определенные антисыворотки, а также готовый комплекс ФИТЦ-у-глобулин. Иммунофлуоресцентный анализ широко применяется в медицинской и санитарной микробиологии, генетике, систематике, экологии микроорганизмов.

Препараты живых клеток. На предметное стекло в каплю раствора акридина оранжевого в воде или 0,5%-ном NaCI в разведении 1:10 000 вносят исследуемую культуру микроорганизмов и накрывают покровным стеклом. Через 2—10 мин микроскопируют при увеличении объектива 40X или 90 X с вазелиновым маслом.

Препараты фиксированных клеток. На предметном стекле готовят мазок, фиксируют и окрашивают нейтральным или слабокислым раствором акридина оранжевого в разведении 1:10 000 2—4 мин. Затем препарат отмывают от избытка флуорохрома в стоячей или слабопроточной воде в течение 5—10 мин, накрывают покровным стеклом (при необходимости добавляя каплю воды) и просматривают с объективом 90X.

Иммунофлуоресцентное окрашивание: прямой метод. На

предметное стекло помещают суспензию клеток или образец, содержащий искомый микроорганизм, подсушивают и фиксируют нагреванием или другим способом. Препарат окрашивают меченной ФИТЦ антисывороткой, поместив его во влажную камеру (чашка Петри с мокрой фильтровальной бумагой). Время взаимодействия подбирают опытным путем; обычно достаточно 20 мин. Затем препарат отмывают в стоячей или слабопроточной воде 2—3 мин, накрывают покровным стеклом и исследуют с объективом 90 X. Так как оболочка клетки непроницаема для антител, они адсорбируются на поверхности клетки, так что возникает характерный «эффект ореола» как один из критериев специфичности. Если в сыворотке есть несвязанный флуорохром, он, проникая в клетку, вызывает ее свечение вследствие неспецифической реакции

Иммунофлуоресцентное окрашивание: непрямой метод. Включает два этапа. Препарат фиксируют нагреванием, наносят каплю нелюминесцирующей гомологичной иммунной сыворотки определенного разведения и оставляют на 20—30 мин во влажной камере. Затем осторожно промывают в течение 5 мин. На втором этапе на препарат наносят каплю меченого антикроличьего f-глобулина, разведенного до так называемого окрашивающего титра. Время инкубации на втором этапе и окрашивающий титр определяют эспериментально. После этого препарат осторожно промывают и микроскопируют при увеличении 90X. Непрямой метод обладает принципиальным преимуществом, так как, имея лишь одну люминесцирующую сыворотку, можно отыскать большое число разных антигенов, используя стандартные кроличьи сыворотки. При непрямом методе, однако, крайне важен контроль, включающий инкубирование препарата на втором этапе непосредственно с меченой сывороткой; обработку препарата гетеро-логичной меченой сывороткой; обработку препарата на первом этапе нормальной или гетерологичной сывороткой, не содержащей антител к исследуемому антигену.

Обнаружение мелких колоний микроорганизмов. Мембранный

фильтр марки «Синпор» с диаметром пор 1 мкм стерилизуют кипячением в дистиллированной воде в течение 20 мин. Через фильтр пропускают исследуемый субстрат (воду, почвенную вытяжку) или суспензию микроорганизмов. Фильтр накладывают тыльной стороной на агаровую пластинку с элективной питательной средой и помещают на 5—б ч в термостат. Затем фильтр с колониями снимают со среды и кладут тыльной стороной на дно чашки Петри, содержащей несколько капель флуорохрома, или диск фильтровальной бумаги, смоченный раствором флуорохрома, например, акридина оранжевого, в разведении 1:5000. Диффундирующий через фильтр флуорохром в течение 5—10 мин окрашивает колонии микроорганизмов. При необходимости фильтр накладывают на фильтровальную бумагу, смоченную физиологическим раствором, для удаления избытка флуорохрома. Фильтры просматривают в синем свете. Микроорганизмы остаются живыми и могут быть использованы для дальнейшего выращивания и изучения.

6.4. МЕТОДЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ

Как уже отмечалось (6.1.5.), электронный микроскоп позволяет исследовать только неживые обезвоженные объекты. Способы подготовки микроорганизмов к наблюдению в сканирующем (СЭМ) и трансмиссионном (ТЭМ) электронных микроскопах имеют свои особенности.

6.4.1. Препараты для просвечивающей электронной микроскопии

Приготовление препаратов включает процессы фиксации, обезвоживания, пропитки и заливки специальными смолами.

Фиксация. Микроорганизмы фиксируют раствором глутарово-го альдегида, раствором оксида осмия или последовательным использованием того и другого. Работу ведут в вытяжном шкафу. Клетки отделяют от среды центрифугированием при 6 ООО об/мин, промывают фосфатным буфером (0,1 н., рН 7,2) и вновь центрифугируют. 5—10 мг биомассы помещают в 1 мл 2,5%-ного охлажденного раствора глутарового альдегида в том же фосфатном буфере и оставляют на 1—2 ч в темноте при +4°. Глутаровый альдегид сливают, клетки промывают 2 раза фосфатным буфером и после центрифугирования заливают 1%-ным водным раствором OSO4. Оставляют на 2—16 ч в темноте при +4°. Раствор оксида осмия сливают и клетки промывают 2—3 раза фосфатным буфером, центрифугируя.

Проп

страница 24
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46

Скачать книгу "Руководство к практическим занятиям по микробиологии" (2.03Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(06.12.2019)