итка смолами. После обезвоживания клетки пропитывают смолами (эпон, аралдит), выдерживая материал в стеклянных бюксах при 37° по 1 ч в системе ацетон: смолы, взятых последовательно в соотношении 3*1, 1:1 и 1:3. Затем клетки переносят в заливочные капсулы и заливают смолами без ацетона. Капсулы выдерживают при комнатной температуре 1 сутки, затем при 37а 1 сутки и при 60° 2 суток. После этого капсулы с включенными в смолы клетками микроорганизмов готовы для заточки и резки на

Обезвоживание. Осадок после фиксации и промывки фосфатным буфером проводят через растворы этанола возрастающей концентрации, каждый раз центрифугируя суспензию: 30°-ный — 2 раза по 5 мин; 50°-ный—1 раз 10 мин; 70°-ный — с 3%-ным уранилацетатом, оставляя на ночь; 96°-ный — 2 раза по 10 мин; 100°-ный — 2 раза по 10 мин. На последнем этапе клетки проводят через ацетон 2 раза по 10 мин.

ультрамикротоме. После нанесения срезов на формваровые сеточки их окрашивают цитратом свинца или уранилацетатом.

6.4.2. Препараты для сканирующей электронной микроскопии: клетки, колонии, споры воздушного мицелия

Подготовка клеток включает три этапа: фиксацию, обезвоживание, напыление металлом.

Фиксация. 20—50 мг сырой биомассы микроорганизмов помещают в 5 мл фосфатного буфера (0,1 н., рН 7,2) в центрифужных пробирках, перемешивают и центрифугируют при 6 000 об/мин 5 мин. К осадку добавляют 2 мл глутарового альдегида в 18 мл того же фосфатного буфера, перемешивают и оставляют на 1 ч в темноте. Затем клетки центрифугируют и промывают фосфатным буфером.

Обезвоживание. Процесс обезвоживания проводят, последовательно помещая осадок клеток на 5 мин в водные растворы этанола концентрации 50, 60, 70, 96 и в конце 100°, каждый раз центрифугируя. Полученный осадок переносят в маленькие бюксы, которые оставляют на ночь открытыми в вытяжном шкафу для полного испарения ацетона. Далее проводят досушивание в критической точке.

Напыление металлом. На поверхность поддерживающего столика наносят тонкий слой клея или лака, на который помещают небольшое количество полученного материала. Столики в специальном приборе напыляют металлом в течение 15 мин.

Микроорганизмы для наблюдения в СЭМ можно подготовить на покровном стекле. Культуру или промытые фосфатным буфером клетки наносят на осколок обезжиренного покровного стекла и высушивают на воздухе. Стекло помещают на 1 ч в глутаровый альдегид (2,5%-ный раствор в фосфатном буфере, 0,1 н., рН 7,2) и промывают затем фосфатным буфером. Далее обезвоживают клетки, последовательно помещая стекла в водные растворы этанола (20, 25, 50, 70, 96; 100°) на 15 мин в каждый и в амилацетат или чистый ацетон на 1 ч. Досушивают в критической точке. Сухие мазки готовы для напыления и просмотра в СЭМ.

С целью изучения архитектоники колоний микроорганизмов их выращивают на мембранных фильтрах (Владипор, №2—5) а проводят фиксацию и обезвоживание в щадящем режиме. Фильтры стерилизуют и помещают на поверхность плотной питательной среды в чашке Петри, инокулируют культурой в определенном разведении и инкубируют в подходящем режиме. Выросшие колонии подвергают фиксации и обезвоживанию, последовательно помещая фильтры в чашки Петри, крышки которых покрыты внутри фильтровальной бумагой, пропитанной следующими веществами: 25%-ный глутаровый альдегид, на 20—30 мин, безводный ацетон или пропиленоксид, 2 раза по 20 мин. После напыления металлом колонии исследуют в СЭМ.

Колонии микроорганизмов можно также последовательно по 20—30 мин фиксировать 25%-ным глутаровым альдегидом и 1—2%-ным водным раствором оксида осмия и после обезвоживания, заливки смолами и ультратомирования исследовать в ТЭМ.

Экзоспоры актином ицетов и грибов готовят к наблюдению в СЭМ следующим образом. К спороносящему воздушному мицелию слегка прикасаются поверхностью поддерживающего столика, покрытой клеем или лаком. Полученный отпечаток подсушивают на воздухе и напыляют металлом. Обращают внимание на расположение и структуру поверхности спор.

ГЛАВА 7

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ УЧЕТ МИКРООРГАНИЗМОВ

О росте микроорганизмов в естественных субстратах или в питательных средах судят по количеству их клеток или биомассе в единице объема. Методы определения этих показателей могут быть прямыми (подсчет клеток под микроскопом, взвешивание на весах) или косвенными. Косвенные методы основаны на измерении параметров, величина которых зависит от количества или биомассы микроорганизмов (число колоний, выросших после высева суспензии клеток на питательную среду, рассеяние или поглощение суспензией клеток света, содержание в ней белка и др.). Выбор метода зависит от целей исследования, свойств питательной среды или субстрата, а также особенностей роста и морфологии микроорганизмов. Так, многие методы, используемые для определения числа одноклеточных микроорганизмов, не приемлемы при подсчете многоклеточных (нитчатых, мицелиальных и др.) форм.

При оценке численности микроорганизмов, особенно в естественных субстратах (прежде всего в почве), необходимо помнить, что их клетки часто находятся в прикрепленном (адгезированном) состоянии или в виде микроколоний. Поэтому перед началом подсчета их нужно отделить от частиц субстрата и друг от друга (де-сорбировать). Выбор метода десорбции (механическое перемешивание суспензии клеток, растирание, обработка ультразвуком, применение поверхностно активных веществ и т. д.) определяется особенностями исследуемого субстрата.

7 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК

7.1.1. Подсчет клеток микроорганизмов под микроскопом

Подсчитать клетки микроорганизмов под микроскопом можно, используя счетные камеры, капилляры Перфильева, препараты фиксированных и окрашенных клеток, приготовленные на предметных стеклах или мембранных фильтрах. Перечисленные методы позволяют определить общее количество клеток в единице объема. Следует помнить, что подсчитываются все клетки, как живые, так и мертвые. Основное ограничение большинства указанных методов — необходимость довольно высоких концентраций клеток в единице исследуемого субстрата.

Подсчет клеток в счетных камерах. Этот метод рекомендуется

использовать для подсчета крупных объектов — дрожжей, одно

клеточных водорослей, конидии грибов и некоторых относительно крупных бактерий. Обычно используют камеру Горяева —? Тома (рис. 55), хотя можно применять и другие счетные камеры. Камера Горяева представляет собой толстое предметное стекло, разделенное бороздками. На центральную часть стекла нанесена сетка. Площадь квадрата сетки указана на одной из сторон предметного стекла и соответствует 1/25 мм2 (большой квадрат) или 1/400 мм2 (малый квадрат). Часть предметного стекла, на которой нанесена сетка, на 0,1 мм ниже двух Других сторон. Это глубина камеры; она всегда указывается на предметном стекле.

При работе с камерой необходимо соблюдать определенный порядок ее заполнения. Вначале углубление с сеткой покрывают специальным шлифованным покровным стеклом и, слегка прижимая, смещают покровное стекло в противоположные стороны до появления колец Ньютона. Это указывает на то, что покровное стекло притерто к сторонам камеры. Только при таком условии объем взвеси микроорганизмов, находящийся в камере, соответствует расчетному. После этого камеру заполняют исследуемой суспензией микроорганизмов. Суспензию вносят через бороздку камеры капилляром или пипеткой. Подсчет клеток рекомендуется начинать через 3—5 мин после заполнения камеры, чтобы клетки осели и при микроскопи-ровании были видны в одной плоскости. Подвижные клетки перед заполнением камеры убивают нагреванием или суспендированием в 0,5%-ном водном растворе формалина.

Число клеток подсчитывают с объективом 8Х или 40х. С иммерсионным объективом работать нельзя, так как его фокусное расстояние меньше толщины стекла камеры. Обычно подсчитывают клетки микроорганизмов в 10 больших или 20 маленьких квадратах сетки, перемещая последние по диагонали. Учитывают все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также клетки, пересекающие верхнюю и правую стороны квадрата. При подсчете количество клеток в большом квадрате не должно превышать 20, а в малом — 10, в противном случае исходную суспензию разводят водопроводной водой. Для получения достоверного результата общее число подсчитанных клеток микроорганизмов должно быть не менее 600.

Точность определения зависит от того, насколько плотно пришлифовано покровное стекло к поверхности камеры, поэтому подсчет клеток повторяют 3—4 раза, каждый раз заново монтируя камеру и заполняя ее исследуемой взвесью микроорганизмов. Это обеспечивает большую точность, чем подсчет 600 клеток при однократном монтаже камеры. Количество клеток в 1 мл исследуемой суспензии вычисляют по формуле

М = п,

hS

где М — число клеток в 1 мл суспензии; а — среднее число клеток в квадрате сетки; h — высота камеры в мм; .S — площадь квадрата сетки в мм2; 103 — коэффициент перевода см3 в мм3; п — разведение исследуемой суспензии.

Подсчет клеток в капиллярах Перфильева. Для изучения и

подсчета микроорганизмов в естественных субстратах иногда применяют капилляры Перфильева. Они имеют прямоугольное сечение и по принципу подсчета аналогичны счетной камере. При погружении капилляра в субстрат (ил, почву и т. д.) он заполняется в силу своих капиллярных свойств. Затем капилляр помещают на предметное стекло, заливают конец расплавленным парафином и подсчитывают клетки, используя объективы 40 X, 90 X или фазово-контрастное устройство.

Длина отрезка капилляра соответствует диаметру поля зрения при данном увеличении микроскопа. Для получения достоверного результата подсчитывают клетки в 50—100 полях зрения. Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата определяют по формуле

М — Я,

hid

где М—количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата; а — среднее число клеток в капилляре, длиной в диаметр поля зрения; h — высота капилляра в мм; /—ширина капилляра в мм; d — диаметр поля зрения (длина капилляра) при данном увеличении микроскопа в мм; 103 — коэффициент перевода сма в мма; п — разведение исследуемого субстрата.

Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках (м