етод Виноградского—Брида). Метод широко используется для определения численности микроорганизмов в различных естественных субстратах — почве, загрязненных водах, молоке, в оптически непрозрачных питательных средах, содержащих нерастворимые в воде компоненты, например, крахмал, соевую муку. Преимущество метода заключается также в том, что фиксированные окрашенные препараты хорошо сохраняются, поэтому подсчет можно проводить в удобное для исследователя время.

Приготовление препарата сводится к следующему. Хорошо обезжиренное предметное стекло помещают на миллиметровую бумагу, на которой отмечен прямоугольник площадью 4 или 6 см2. Затем на стекло из микропипетки наносят точно измеренный объем исследуемой суспензии (0,01, 0,02 или 0,03 мл) и каплю 0,03—0,1%-ного водного раствора агара. Нанесенную суспензию равномерно распределяют петлей но площади, отмеченной на миллиметровой бумаге. Препарат подсушивают на воздухе, фиксируют 10—20 мин 96°-ным спиртом и окрашивают 1—2 мин фуксином Циля или любым другим красителем. Краситель сливают, препарат промывают, последовательно погружая стекло в 4—5 стаканов с водой (промывать препарат под струей водопроводной воды не следует), и высушивают на воздухе. В таком виде препараты хорошо сохраняются.

Количество клеток подсчитывают с иммерсионным объективом в квадратах окулярной сетки, которую помещают в окуляр между собирательной и глазной линзами. При отсутствии сетки подсчитывают число клеток в поле зрения микроскопа. Для максимального использования оптических возможностей микроскопа рекомендуется иммергировать конденсор. Следует иметь в виду, что использование ахроматов не дает одинаково четкой картины в центре поля зрения и по его краям, что затрудняет подсчет. Правила подсчета в квадратах окулярной сетки те же, что и при подсчете клеток в квадратах сетки счетной камеры. Чтобы результат был достоверным, клетки микроорганизмов рекомендуется подсчитывать в 50—100 полях зрения. Общее количество подсчитанных клеток не должно быть менее 600. Количество клеток микроорганизмов, содержащихся в 1 мл исследуемого субстрата, вычисляют по формуле

М = — П.

sV

где М — количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата; а — среднее число клеток в квадрате окулярной сетки (поле зрения); 5 — площадь квадрата окулярной сетки (поля зрения) в мкм2; V — объем нанесенной на стекло суспензии в мл; 5 — площадь приготовленного мазка в мкм2; /г — разведение исследуемого субстрата.

Площадь квадрата сетки или поля зрения определяют с помощью объект-микрометра. Последний помещают на столик микроскопа вместо препарата и при том же увеличении, при котором проводили подсчет, определяют сторону квадрата окулярной сетки или диаметр поля зрения (см. гл. 6). Площадь поля зрения вычисляют по формуле s — яг2.

Подсчет клеток на мембранных фильтрах. Этот метод рекомендуется использовать для определения численности микроорганизмов в субстратах с низкой плотностью клеток. Его применяют при определении количества микроорганизмов в различных водоемах, при санитарно-бактериологических и некоторых других исследованиях. Фильтрование пробы определенного объема (от нескольких миллилитров до десятков литров) позволяет сконцентрировать на поверхности фильтра содержащиеся в пробе клетки микроорганизмов. Затем их окрашивают и подсчитывают.

Для фильтрования выбирают фильтр, который задерживает микроорганизмы, находящиеся в исследуемом субстрате. Характеристика мембранных фильтров приведена в гл. 3. Перед использованием каждую партию фильтров необходимо проверять, так как иногда они бывают сильно загрязнены бактериями. Для этого-3—5 фильтров кипятят в дистиллированной воде, окрашивают карболовым эритрозином, как указано ниже, и просматривают под микроскопом. Фильтры с большим загрязнением микроорганизмами для подсчета клеток не используют. Пригодные для работы фильтры кипятят в дистиллированной воде для удаления воздуха1 и остатков растворителей; воду следует 2—3 раза сменить. Кипячение не должно быть слишком бурным, иначе фильтры будут скручиваться. После этого фильтр матовой стороной вверх помещают на пористую пластинку специального держателя и пропускают через него точно измеренный объем исследуемой пробы. Подробно о технике фильтрования через мембранные фильтры см. гл. 3.

Чем больше плотность клеток в исследуемом материале, тем меньше должен быть фильтруемый объем, и наоборот. Клетки микроорганизмов, осевшие на фильтре, окрашивают карболовым эритрозином. Для этого фильтр помещают нижней стороной в чашку Петри на фильтровальную бумагу, увлажненную красителем, чашку закрывают крышкой и оставляют на 3—5 ч или даже на сутки. Для равномерного окрашивания клеток мембранный фильтр должен плотно прилегать к бумажному фильтру с эритрозином. Затем мембранный фильтр отмывают от красителя, перекладывая его в чашки Петри с фильтровальной бумагой, обильно смоченной дистиллированной водой, до тех пор, пока он не перестанет окрашивать влажную фильтровальную бумагу. После отмывания фильтр высушивают на воздухе и готовят препарат для микроскопирования. На предметное стекло капают иммерсионное масло и помещают на него окрашенный мембранный фильтр так, чтобы клетки микроорганизмов были сверху. На поверхность мембранного фильтра наносят еще каплю иммерсионного масла и покрывают фильтр покровным стеклом.

Количество клеток микроорганизмов подсчитывают с иммерсионным объективом 90X в квадратах окулярной сетки или в поле зрения микроскопа. Правила подсчета аналогичны тем, которые изложены для метода Виноградского. Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле

где М — количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата; а — среднее количество клеток в квадрате окулярной сетки (поле зрения); F — площадь мембранного фильтра в мм2; V — объем (мл) профильтрованной жидкости; 106 — коэффициент перевода мм2 в мкм2; s — площадь квадрата окулярной сетки (поля зрения).

При выявлении и количественном учете микроорганизмов широко применяют люминесцентную микроскопию (см. гл. 6). Препараты микроорганизмов готовят непосредственно из исследуемой суспензии и ее разведений либо концентрируют клетки на специально обработанных нефлуоресцирующих фильтрах. Препараты и фильтры с микроорганизмами обрабатывают акридином оранжевым или другими красителями. Принципы подсчета при люминесцентной и светлопольной микроскопии одинаковы, однако окрашенные флуорохромами клетки более четко видны на темном фоне препарата и хорошо отличимы от небиологических объектов (частиц ила, почвы и т. д.). Это позволяет вести их подсчет более точно.

Люминесцентная микроскопия дает также возможность выявить и оценить численность отдельных групп микроорганизмов в исследуемой пробе. Это достигается в результате использования специальных флуорохромов (например, калькофлуора белого — для выявления грибов), методов иммунофлуоресценции и др.

7.1.2. Определение числа клеток микроорганизмов высевом на питательные среды

Определение количества клеток высевом на плотные пита-тельные среды (чашечный метод Коха). Метод широко применяют для определения численности жизнеспособных клеток в различных естественных субстратах и в лабораторных культурах. В его основе лежит принцип Коха, согласно которому каждая колония является потомством одной клетки. Это позволяет на основании числа колоний, выросших после посева на плотную питательную среду определенного объема исследуемой суспензии, судить об исходном содержании в ней клеток микроорганизмов. Результаты количественного учета микроорганизмов, проведенного методом Коха, часто выражают не в числе клеток, а в условных единицах — так называемых колониеобразующих единицах (КОЕ).

В отличие от подсчета микроорганизмов под микроскопом этот метод дает возможность определить только число жизнеспособных клеток в популяции. Поскольку сред, пригодных для роста всех микроорганизмов, не существует, метод высева дает возможность определить число микроорганизмов, способных расти на среде данного состава, но не позволяет учесть те микроорганизмы, которые не растут или растут крайне медленно. Это важно помнить при анализе таких естественных субстратов, как почва, вода и т. п.

Определение числа микроорганизмов этим методом включает три этапа: приготовление разведений, посев на плотную среду в чашки Петри и подсчет выросших колоний.

Приготовление разведений. Численность популяции микроорганизмов обычно велика, поэтому для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений. Разведения готовят в стерильной водопроводной воде или 0,85%-ном растворе NaCl (физрастворе). В ходе опыта целесообразно использовать один и тот же коэффициент разведения, например 10, что уменьшает вероятность ошибки.

Для приготовления разведений стерильную водопроводную воду разливают по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1 мл исследуемой суспензии стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 мл стерильной воды — это 1-е разведение, 10~!. Полученное разведение тщательно перемешивают новой стерильной пипеткой, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру выполняют 3—5 раз, затем той же пипеткой отбирают 1 мл полученной суспензии и переносят во 2-ю пробирку — получают 2-е разведение (10^2). Таким же образом готовят и последующие разведения. Степень разведения зависит от плотности исследуемой популяции микроорганизмов; соответственно она тем больше, чем больше плотность популяции.

Для приготовления каждого разведения следует обязательно использовать новую пипетку. Пренебрежение этим правилом приводит к получению ошибочного результата.

Посев. Высевать суспензию можно поверхностным или глубинным способом. Перед посевом поверхностным способом (рис 56) разливают расплавленную, чаще всего агаризованную, питательную среду в ряд стерильных чашек Петри по 15—20 мл в каждую Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока среда не застынет. Поверхность агаризованных сред перед посевом рекомендуется подсушивать для удаления конденсационной воды.

Среду можно подсушить, поместив чашки в термостат на