Биологический каталог




Руководство к практическим занятиям по микробиологии

Автор М.Н.Пименова, Н.Н.Гречушкина, Л.Г.Азова, А.И.Нетрусов и др.

ДНК

Для выделения нуклеиновых кислот из клеток обычно применяют мягкие методы их разрушения, включающие использование детергентов и лизоцима, хотя для разрушения некоторых микроорганизмов с прочными клеточными стенками может понадобиться пресс, стеклянные бусы или растирание клеток с абразивами (см. раздел 8.1.2). В некоторых случаях для «ослабления» клеточных стенок в растущие культуры (например, грамположительных бактерий) добавляют глицин, лизин или треонин. Иногда для тех же целей клетки грамположительных бактерий в растущих культурах обрабатывают антибиотиками, такими как пенициллин С или ме-тициллин, которые подавляют биосинтез пептидогликана клеточной стенки. Чувствительность к лизоциму микобактерий, содержащих высокий процент липидов и полисахаридов в клеточной стенке, может быть усилена их обработкой изопропанолом. При лизисе микроорганизмов, имеющих особенно прочные клеточные стенки,, применяют поли(этиленгликоль) с последующим удалением из-лизата, так как его присутствие мешает проведению дальнейшей очистки ДНК.

Очистку ДНК из разрушенных клеток ведут последовательным отделением от белков обычно с использованием смесей хло-роформ-изоамиловый спирт или фенол-хлороформ и многократным переосаждением ДНК этанолом. От следов РНК препараты ДНК освобождают с помощью РНКазы, а от следов белка — с помощью» протеаз. ДНК сушат под вакуумом и хранят при 4°.

8.3.2. Определение нуклеотидного состава ДНК

Для определения молярного содержания ГЦ (%) в ДНК чаще всего применяют два метода: основанный на измерении плавучей плотности или анализе кривых температуры плавления (Тт) выделенных ДНК. В качестве стандарта в обоих случаях применяют ДНК известного состава, выделенную тем же методом. Оба метода быстрые и дешевые, хотя более точным является метод фракционирования ДНК на основания и количественное определение каждого нуклеотида в отдельности с использованием хроматографии на бумаге. Однако этот метод более длителен, трудоемок и для получения воспроизводимых результатов необходима тщательная очистка препарата ДНК от РНК-Различия в спектрах поглощения очищенных ДНК также могут быть использованы при определении их состава в сравнении с препаратом ДНК известного процентного содержания ГЦ. Этот метод дает быстрое и точное определение. Он считается удобной альтернативой, если оборудование для определения плавучей плотности или термальной денатурации ДНК недоступно.

Метод тепловой денатурации основан на разрушении водородных связей между комплементарными цепями нативной ДНК и их расхождении друг от друга при повышении температуры раствоpa ДНК. Однонитевые ДНК имеют поглощение при 260 нм примерно на 40% больше, чем двунитевые. При нагревании раствора ДНК процент однонитевых ДНК увеличивается и наблюдается увеличение поглощения при 260 нм (гиперхромизм). Термостабильность водородных связей между гуанином и цитозином в ДНК выше по сравнению со связями между аденином и тимином. Поэтому, чем выше содержание Г + Ц пар в молекуле ДНК» тем больше энергии требуется для расхождения нитей. После расхождения цепей ДНК поглощение при 260 нм раствора с повышением температуры не увеличивается. Значение температуры плавления (Тт) соответствует температуре, при которой в растворе содержится 50% разошедшихся нитей ДНК (температура 50%-ного гиперхромизма). Эти значения линейно соответствуют молярному содержанию ГЦ в ДНК между 30 и 70%.

Широко используют следующую модификацию этого метода. Раствор ДНК доводят до плотности приблизительно 25 мкг/мл (А2бо=0,50) в 1-сантиметровых кварцевых кюветах с герметичными крышками и термопарой (фиксирующей температуру), конец которой должен быть непосредственно под поверхностью раствора. Кюветы помещают в регистрирующий спектрофотометр с тер-мостатирующим устройством. Температуру устанавливают равной 25° и регистрируют поглощение в опытной кювете при 260 нм против контрольной с растворителем. Температуру медленно повышают (0,5°/мин) и проводят постоянную регистрацию изменения поглощения. Значение температуры, дающее 50%-ное увеличение поглощения, будет соответствовать значению Тт для данной ДНК.

Поскольку значения молярного содержания ГЦ (%) и Тт связаны линейно, то расчет для неизвестной ДНК производится сравнительно просто. На расчеты влияют концентрации буферных растворов, в которых проводят измерения, так как значение Тт логарифмически зависит от концентрации иона натрия в растворе. Наиболее широко применяемым при измерении значений тепловой денатурации буфером является цитратно-солевой (1SSC, 0,015 М тризамещенного цитрата натрия в 0,15 М NaCI, рН 7,0). Для этого буферного раствора установлено следующее соотношение:

молярное содержание ГЦ, % =2,44 Тт — 169,00.

В случае ДНК с высокими молярными ГЦ, % используют более разбавленные буферные растворы, например 0,33 или 0,1-кратный раствор SSC Для таких растворов уравнения выглядят следующим образом:

0,33-SSC : молярное содержание ГЦ, %=2,47 Тт—135,14; 0>1-SSC : молярное содержание ГЦ, %=2,08 Гт—106,40.

С целью воспроизводимости результатов, проверки метода и аппаратуры необходимо регулярно определять данным методом содержание ГЦ в ДНК из Е. со/ГАТСС 11775, поскольку этот штамм является международным стандартом и Тт его ДНК в 1-SSC равна 90,5°, а значение плавучей плотности —1,710.

Метод определения состава ДНК по плавучей плотности основан на том, что если раствор ДНК подвергнуть высокоскоростному центрифугированию в градиенте плотности CsCl, то через определенное время она займет в градиенте место, соответствующее своей плавучей плотности. Значение плотности ДНК в середине пика, формируемого в центрифужной пробирке, называется плавучей плотностью ДНК. Она линейно зависит от молярного содержания ГЦ, %, Метод был впервые описан в 1962 г. и с тех пор не претерпел значительных модификаций.

Измерение плавучей плотности ДНК производят следующим образом. Сухой CsCl растворяют в буфере (50 мМ грис-HCl, рН 7,3) до плотности 1,7 г/см3 и вносят 2—3 мкг исследуемой и репер-ной (с известным составом) ДНК. Растворы переносят в чистые и сухие центрифужные пробирки, помещают в аналитическую центрифугу и центрифугируют при 150 тыс. g в течение 20 ч при 25°. За это время градиент обычно формируется полностью.

Плавучая плотность неизвестной ДНК рассчитывается с использованием расстояния между серединой ее пика и серединой пика реперной ДНК на градиенте плотности CsCl. Маркерная ДНК должна быть выбрана заранее, чтобы ее пик не перекрывал пик определяемой ДНК. Нуклеотидный состав ДНК и ее плотность (р) связана следующей зависимостью:

Р= 1,660+0,098 (Г + Ц). 8.3.3. Гибридизация нуклеиновых кислот

Методы гибридизации ДНК/ДНК и ДНК/рРНК получили в последние годы широкое распространение при идентификации новых штаммов бактерий. Они позволяют* установить степень генетического родства изучаемого штамма с определенным родом, видом или выявить штаммовые различия. Принцип метода заключается в денатурации выделенной двухцепочечной ДНК нагреванием и фиксации разошедшихся цепей на фильтрах. При понижении температуры возможна ренатурация цепей, причем соединиться с цепью может только комплементарная ей последовательность оснований, а температура связывания во многом определяет результаты опыта. Количество ренатурированной двуспиральной ДНК служит прямой мерой сходства геномов сравниваемых организмов, причем последовательности, образующие двухцепочечные комплексы, не обязательно комплементарны по всем нуклеотидам.

При гибридизации фрагменты одноцепочечной ДНК известного микроорганизма (ДНК-репер) закрепляют на фильтре и добавляют радиоактивно меченные фрагменты одноцепочечной ДНК изучаемого штамма. Контролем служит связывание гомологичной реперу ДНК (100%-ная гибридизация). Меченая ДНК (зонд) должна составлять в опыте не более 1:300—1:500 части от прикрепленной к фильтру немеченой ДНК-репера. Связывание зонда в пределах 100—70% считают штаммовыми различиями, 70—

50% —? различиями видовыми, менее 50% — различиями на уровне рода. Данный метод удобен и объективен, однако может применяться лишь для определения сходства бактерий на уровне рода и более низком таксономическом уровне.

Для проведения гибридизации клетки изучаемого штамма разрушают тем или иным способом (см. 8.1), выделяют ДНК, фраг-ментируют ее ультразвуком на кусочки длиной 300—350 пар оснований (определяется электрофорезом в 1%-ной агарозе), денатурируют нагреванием и закрепляют на нитроцеллюлозных фильтрах. ДНК сравниваемого штамма готовят таким же способом, вводят реактивную метку ник-трансляцией с помощью меченого нукле-озид-5'-трифосфата при одновременном действии ДНКазы 1 и ДНК полимеразы 1 Е, coli и используют для гибридизации. Ее чаще всего проводят по методу Денхардта в 20%-ном формамиде при 62° в течение 18—24 ч («мягкая ренатурация»), отмывают от несвязавшейся меченой ДНК, и радиоактивность фильтров просчитывают в сцинтилляционном счетчике. Гибридизацию гомологичных ДНК принимают за 100% и рассчитывают проценты связанной исследуемой ДНК с ДНК реперного штамма. Процент связанной ДНК отражает степень гомологии молекул и служит показателем родства штаммов. Аналогичная реассоциация может быть осуществлена между молекулами ДНК и рРНК, поскольку двойные спирали образуются также между одноцепочечными ДНК и комплементарными цепями РНК. Подробнее методы описаны в справочном руководстве (Герхард и др., 1984).

8.3.4. Каталогизация нуклеотиДных последовательностей 5$ и 16S рРНК

Гибридизации ДНК—ДНК и ДНК—рРНК требуют прямого экспериментального сравнения изучаемых микроорганизмов. В отличие от этого методы анализа генома, построенные на определении последовательностей нуклеотидов в высококонсервативных полимерных молекулах клетки, таких как 5S, 16S (18S) или 23S (28S) рРНК, дают возможность оценивать данные, полученные в разное время и в разных лабораториях. С помощью сравнения последовательностей нуклеотидов можно проводить филогенетический анализ любых организмов, как про- так и эукариотных, и строить эволюционные деревья, что важно для определения степени их родства и путей эвол

страница 31
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46

Скачать книгу "Руководство к практическим занятиям по микробиологии" (2.03Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(06.12.2019)