ислоты. Для определения способности расти на средах с органическими кислотами рекомендуется плотная среда состава (г/л): (NH4)2HP04 — 0,5; MgS04-7H20 —0,2; NaCl — 0,1; агар — 15,0; органическая кислота в виде соли Na или К — 2,0; рН 6,8. До стерилизации к среде добавляют 20 мл 0,04%-ного водного раствора индикатора фенолрот, который в интервале рН 6,8—8,4 изменяет окраску от желтой к красной. Среду разливают в пробирки и стерилизуют при I ати. Посев проводят уколом, продолжительность культивирования от 2 до 14 суток в зависимости от скорости роста микроорганизмов. О потреблении органических кислот свидетельствует рост по уколу и изменение кислотности среды в щелочную сторону, что отчетливо заметно по цвету индикатора.

Некоторые микроорганизмы способны использовать и такие химически устойчивые соединения, как углеводороды. Выявить способность микроорганизма окислять жидкие нелетучие углеводороды можно на плотной среде состава (г/л): KNO3 — 4,0; КН2Р04 — 0,6; Na2HPO4-12H20 — 1,4; MgS04-7H20 — 0,8; выщелоченный агар — 2,0; рН 7,2. Среду стерилизуют в колбах при 1 ати и разливают в чашки Петри толстым слоем. После того как среда застынет, в центре агаровой пластинки вырезают лунку. Для этой цели можно воспользоваться пробочным сверлом (диаметр 8—10 мм), которое предварительно стерилизуют в пламени горелки. Микроорганизмы высевают радиальными штрихами от лунки к периферии чашки (рис. 63). В лунку вносят 2—3 капли исследуемого углеводорода 1. На чашке с одним углеводородом можно проверить рост нескольких микроорганизмов. Чашки помеСггерилизуют фильтрованием.

Рис 63. Определение способности микроорганизмов использовать

углеводороды:

а — схема посева; /—6 — штрихи различных микроорганизмов; в центре — лунка с жидким углеводородом; б — рост различных

культур

щают в термостат строго горизонтально, не переворачивая. Через 7—10 суток отмечают наличие или отсутствие роста по штриху в сравнении с контролем — ростом на среде без углеводорода.

9.2.2. Использование соединений азота

Для определения способности микроорганизмов использовать те или иные соединения азота их выращивают на соответственных питательных средах.

Использование органических азотсодержащих веществ. Многие микроорганизмы могут усваивать азот органических соединений, например, пептонов, аминокислот и белков. В процессе ферментативного гидролиза белка освобождаются аминокислоты, которые используются клеткой непосредственно в процессах биосинтеза, а также подвергаются расщеплению в результате дыхания или брожения до более простых соединений. Поэтому разложение белка микроорганизмами (аммонификация) всегда сопровождается образованием побочных продуктов: аммиака, который выделяется при дезаминировании аминокислот, сероводорода, освобождающегося при разрушении серосодержащих аминокислот (цистина, цистеина, метионина), а также индола, который образуется при распаде триптофана. Обнаружение этих продуктов в культурах свидетельствует об использовании аминокислот микроорганизмами. Процесс аммонификации всегда сопровождается повышением щелочности среды.

Обнаружение аммиака. Способность микроорганизмов образовывать аммиак можно выявить при их росте в мясо-пептон-ном бульоне. Для этого МПБ разливают в пробирки по 8—10 мл в каждую и стерилизуют при 1 ати. После посева под ватной

пробкой укрепляют узкую стерильную полоску лакмусовой бумаги так, чтобы она не соприкасалась с питательной средой (рис. 64). Пробку рекомендуется заворачивать в полиэтилен, чтобы затруднить улетучивание аммиака. При образовании аммиака красный лакмус синеет.

Рис. 64 Обнаружение сероводорода, образуемого микроорганизмами: 1 — почернение свинцовой бумаги; 2 — образование в толще среды

Если используют пелтонную воду, то образование аммиака выявляют с помощью реактива Несслера. На фарфоровую пластинку помещают несколько капель культу-ральной жидкости и добавляют к ним каплю реактива Несслера. В присутствии следов аммиака жидкость окрашивается в желтый цвет, при большом количестве аммиака образуется коричневый осадок.

Обнаружение сероводорода. Выявление способности бактерий продуцировать H2S основано на реакции образования сульфидов металлов. Наиболее распространенный способ — проба с уксуснокислым свинцом. Микроорганизмы выращивают в МПБ, содержащем 0,01 % цистина и цистеина, которые добавляют к стерильному бульону в виде раствора в подкисленной дистиллированной воде. Растворы цистеина и цистина стерилизуют фильтрованием. После посева исследуемых бактерий над средой помещают стерильную полоску фильтровальной бумаги, пропитанную насыщенным раствором уксуснокислого свинца , укрепив ее под ватной пробкой. Пробку пробирки заворачивают полиэтиленом, чтобы затруднить улетучивание H2S. Продолжительность культивирования 7—10 суток. Выделение сероводорода обнаруживают по почернению бумаги вследствие образования сульфида свинца.

Более четкие результаты наблюдаются при использовании среды следующего состава (г/л): пептон — 10,0; NaCl — 5,0; цитрат NH4Fe — 0,30; агар — 15,0; дрожжевой автолизат — 2,0 мл; вода водопроводная, рН среды 7,0. Среду разливают в пробирки, стерилизуют при 0,5 ати, после стерилизации скашивают и делают посев штрихом. О выделении H2S судят по почернению среды вследствие образования сульфида железа — FeS (рис. 64).

Обнаружение индола. Индол обнаруживают по качественной реакции с реактивом Эрлиха (приготовление реактива см. Приложение). Для выявления индола можно использовать различные среды: МПБ с 0,01% триптофана; 1%-ную казеиновую воду (г/100 мл: казеин — 1,0; Na2HP04 — 0,2; NaCl — 0,3) или

2—3%-ную пептонную воду (г/100 мл: пептон — 2,5; Na2HP04 — 0,2; NaCI — 0,3); рН сред 7,2—7,4. Среды разливают в пробирки по 8—10 мл, стерилизуют при 1,0 ати и засевают суспензией бактерий. Через 5—7 суток проводят качественную реакцию на присутствие индола в культуре и в контроле — стерильной среде. Для этого на поверхность среды, не перемешивая, помещают, 1—2 мл реактива Эрлиха; появление красной окраски свидетельствует об образовании индола.

Субстратами аммонификации могут быть и более простые органические соединения азота, например мочевина. Ферментативный гидролиз мочевины до аммиака и углекислоты способны осуществлять микроорганизмы, образующие уреазу. Образовавшийся аммиак используется этими бактериями в качестве источника азота. Процесс аммонификации мочевины сопровождается сильным под-щелочением среды.

Для выявления способности микроорганизмов использовать мочевину часто применяют среду следующего состава (г/л): (NH4)2 С03 — 5,0; К2НРО4 — 0,5; яблочнокислый, лимоннокислый или виннокислый Na — 5,0. Среду без мочевины наливают в конические колбы тонким слоем и стерилизуют при 0,5 ати. Мочевину добавляют к стерильной среде в виде более концентрированного раствора в подкисленной дистиллированной воде, простери-лизованного также при 0,5 ати. После засева среды микроорганизмами под ватной пробкой укрепляют стерильную полоску красной лакмусовой бумаги. Продолжительность культивирования 3—5 суток. Образование аммиака обнаруживают по изменению цвета лакмусовой бумаги, а также качественной реакцией с реактивом Несслера.

Использование азота минеральных солей. Способность микроорганизмов использовать соли аммония или нитраты в качестве источника азота проверяют на синтетических средах. Готовят два варианта среды. Состав основной среды (г/л): глюкоза — 20,0; К3НРО4 — 1,0; КН2Р04 — 1,0; MgS04-7H20 — 0,5; NaCI — 0,5; раствор микроэлементов (с. 155) — 1мл; агар —15,0; рН 7,1—7,2. В первом варианте к основной среде добавляют NH4C1 — 1,0 и СаСОз — 5,0, так как хлористый аммоний — физиологически кислая соль (с. 44), во втором варианте (KNO3—1,0. Среды разливают в пробирки, стерилизуют при 0,5 ати и после стерилизации скашивают. Посев проводят штрихом, продолжительность культивирования— 2—10 суток. Рост или его отсутствие отмечают визуально.

Способность усваивать аммонийные соли или нитраты можно проверить и на жидких средах того же состава. В этом случае по окончании опыта целесообразно установить полноту использовання данной соли. С этой целью в культуральной жидкости определяют присутствие ионов аммония или нитратов качественными реакциями (с. 159, 164). Для контроля проводят реакции с соответствующей стерильной средой.

9.2.3. Использование молекулярного азота

О способности аэробных микроорганизмов использовать молекулярный азот можно судить по их росту на безазотистой среде Эшби, которая имеет следующий состав (г/л): маннит — 20,0; КдНРО* — 0,2; MgS04 — 02; NaCl — 0,2; K2SO4 — 0,1; СаСОз — 5,0; агар — 20,0; рН 7,1—7,3. Среду разливают в пробирки,стерилизуют при 0,5 ати и готовят скошенный агар. Посев проводят штрихом. Продолжительность культивирования — 7—10 суток. Необходимо отметить, что на среде Эшби могут расти не только микроорганизмы, фиксирующие молекулярный азот, но и олиго-нитрофилы, т. е. микроорганизмы, способные усваивать ничтожные количества связанного азота, содержащегося в реактивах, воде и воздухе. Обильный рост на среде Эшби может свидетельствовать о принадлежности бактерий к азотфиксаторам.

Молекулярный азот могут фиксировать и анаэробные бактерии. Для выявления этой способности у представителей рода Clostridium используют среду следующего состава (г/л): дрожжевой экстракт — 0,015; глюкоза — 20,0; К2НРО4 — 11,0. MgS04X Х7Н20 — 0,5; NaCl, MTIS04 и FeS04 — следы (по 1 мл 1%-ного раствора каждой соли); СаСОз — 20,0; рН 7,0. Среду разливают в высокие пробирки и стерилизуют при 0,5 ати. После стерилизации пробирки доливают почти до пробки стерильной средой и прогревают на кипящей водяной бане в течение 20—30 мин для удаления растворенного в среде кислорода. Затем среду в пробирках быстро охлаждают под струей холодной воды и проводят посев суспензией микроорганизмов. Посевной материал вносят пипеткой на дно пробирки. Продолжительность культивирования — 2—7 суток. По окончании опыта отмечают рост азотфиксаторов (помутнение среды, образование газа, появление запаха масляной кислоты) или его отсутствие.

9.2.4. Отношение к молекулярному кислор