оду и рост в анаэробных условиях

По отношению к молекулярному кислороду среди микроорганизмов выделяют группы облигатных аэробов и микроаэрофи-лов, факультативных, аэротолерантных и строгих анаэробов. Чтобы судить о принадлежности микроорганизмов к той или иной группе, микробную суспензию высевают в пробирки с расплавленной и остуженной до 40—45 °С агаризованной питательной средой. Посев можно проводить и уколом. Строгие аэробы растут на поверхности среды и в верхнем слое. Микроаэрофилы — на некотором расстоянии от поверхности. Факультативные анаэробы обыч

а

но развиваются по всей толще среды. Строгие анаэробы растут только в глубине среды, у самого дна пробирки (рис. 65).

Факультативные анаэробы хорошо» растут и в аэробных, и в анаэробных условиях. В анаэробных условиях многие из них способны использовать в качестве конечного акцептора электронов не кислород, а нитраты. В ходе этого процесса, называемого нитратным дыханием, нитраты восстанавливаются до нитритов, и далее до N20 и газообразного азота. В случае образования этих газообразных продуктов говорят о денитри-фикации. Другие факультативные анаэробы могут в анаэробных условиях переключаться с дыхания на брожение, и тогда в средах с углеводами накапливаются значительные количества органических кислот и других продуктов метаболизма.

Рис. 65, низмов лом (о)

Определение способности к аэробному дыханию. Тест на дыхание (поглощение молекулярного кислорода) проводят с использованием полярографа и платина-хлорсеребряного электрода «закрытого» типа, позволяющего регистрировать дыхание в небольших по объему образцах. Полярограф представляет собой прибор с термостатированной перемешиваемой ячейкой для определения дыхания и автоматической регистрацией изменения силы тока, линейно связанной с концентрацией кислорода в ячейке. Следует помнить, что концентрация кислорода в ячейке зависит от температуры, молярности буфера и атмосферного давления. При комнатной температуре (21°) и нормальном давлении (760 мм рт. ст.) в литре дистиллированной воды, насыщенной воздухом, растворено 7 мг кислорода, что соответствует примерно 500 натомов Ог/мл.

Для измерения скорости дыхания клетки аэробных микроорганизмов, выращенные на соответствующих средах, собирают центрифугированием (режим зависит от величины клеток), промывают физиологическим или буферным раствором с оптимальным для данного объекта рН и суспендируют в небольшом объеме буфера из расчета примерно 3 мл на 1 г осадка сырых клеток. Клетки в. течение эксперимента хранят на льду. В ячейку полярографа вносят клетки (обычно 0,1 объема ячейки) и добавляют проаэриро-ванный буфер той же температуры. Регистрацию поглощения кислорода следует проводить в термостатированных ячейках при температуре, близкой температуре выращивания испытуемого микроорганизма. Регистрируют поглощение 02 пробой без субстрата (эндогенное дыхание), затем шприцем добавляют соответствующий субстрат (обычно 10~2—Ю-3 М). Регистрацию ведут в течение нескольких минут, причем в первый период времени после добавления субстрата дыхание должно быть линейным, т. е. его скорость не должна изменяться со временем. Если такой линейности не наблюдается, можно попытаться снизить концентрацию клеток или увеличить скорость движения ленты самописца.

В качестве теста на функционирование терминальных оксидаа можно добавить в ячейку с клетками ингибиторы, цианид или азид (Внимание! Сильнейшие яды!). Их добавляют до конечной концентрации Ю-4—Ю-3 М, в таких условиях клетки теряют способность поглощать кислород.

Расчет скорости дыхания проводят по ленте самописца, учитывая скорость поглощения клетками кислорода в первые 1—3 мин после добавления субстрата; рассчитывают также степень подавления дыхания (в %) при той или иной действующей концентрации ингибитора. Данные рассчитывают на миллиграмм общего клеточного белка (см. гл. 8).

Для калибровки шкалы полярографа проводят измерения содержания кислорода в насыщенной воздухом дистиллированной воде (100% кислорода) и в той же пробе после добавления 10~2М дитионита натрия (0% кислорода).

Способность к денитрификации определяют на среде следующего состава (г/л): глицерин — 10,0; дрожжевой экстракт — 5,0; (NH4)2S04 — 2,0; KNO3 — 10,0; К2НРО4 — 2,0; MgS04-7H20 — 0,025; NaCl — 0,5; FeS04-7H20 — 0,001; агар — 1,0. Среду разливают в пробирки по 5 и 10 мл и стерилизуют при 0,5 ати. Исследуемый микроорганизм вначале засевают в пробирки с 5 мл среды (1-й пассаж). Посев делают уколом. Через 24 ч петлю культуры 1-го пассажа переносят в пробирки с 10 мл среды, которую предварительно расплавляют и охлаждают до 40—45°. После внесения микроорганизмов среду перемешивают, остужают и заливают 2—3 мл стерильного 1%-ного водного агара для создания анаэробных условий. Рост бактерий, способных к денитрификации, сопровождается помутнением среды и выделением газа.

Проверить способность бактерий к восстановлению нитратов можно и на МПБ, к которому добавляют 0,2% KNO3. Среду разливают в пробирки по 10 мл, опускают на дно каждой поплавок и стерилизуют при 1 ати. Посев проводят суспензией клеток. Продолжительность культивирования — 2—5 суток. По окончании опыта отмечают накопление в поплавке газа (N2) и определяют качественными реакциями присутствие в культуральной жидкости нитратов и нитритов.

Реакция на нитраты с д и ф е н и л а м и н о м. На фарфоровую пластинку наносят каплю концентрированной серной кислоты, помещают в нее несколько кристаллов дифениламина и после его растворения добавляют каплю исследуемой жидкости. При наличии ионов NO3 жидкость окрашивается в темно-синий Цвет. Следует иметь в виду, что азотистая кислота также дает с дифениламином синее окрашивание. Поэтому пробу на нитраты можно проводить только при отсутствии в среде нитритов.

Крахмал-йодная реакция на нитриты основана на том, что нитриты в кислой среде окисляют йодистый цинк с выделением йода, присутствие которого обнаруживают с крахмалом. Для проведения реакции к капле культуральной жидкости добавляют каплю раствора, содержащего ZnCl2, Kl и крахмал (приготовление реактива см. Приложение), и каплю раствора HCI. При наличии в среде нитритов появляется синее окрашивание.

Реакция на нитраты с реактивом Грисса основана на образовании в кислой среде в присутствии нитритов и ароматических аминов (сульфофеноловой кислоты и а-нафтиламина) азосоединения, окрашенного в красно-розовый цвет. Для проведения реакции к капле реактива Грисса (приготовление реактива см. Приложение) добавляют каплю культуральной жидкости. Появление красного окрашивания свидетельствует о присутствии нитритов. Параллельно проводят реакции со стерильной средой.

Определение способности к брожению проводят обычно на углеводно-пептонной среде с относительно высокой концентрацией углеводов и небольшим количеством пептона. Состав среды (г/л): углевод — 10,0; пептон — 2,0; NaCI — 5,0; К2НРО4 — 0,3; агар — ЗД На 100 мл среды добавляют 0,3 мл 1%-ного водного раствора бромтимолового синего, рН среды 7,1—7,2. Среду без углевода стерилизуют при 1 ати. Углеводы (глюкозу, сахарозу, лактозу) добавляют к стерильной расплавленной среде в виде растворов в дистиллированной воде, которые стерилизуют при 0,5 ати. Стерильную среду с углеводами разливают в стерильные пробирки слоем 5—6 см и после того, как она застынет, ее засевают исследуемым микроорганизмом. Посев делают уколом. Для каждого углевода используют две пробирки. После посева поверхность среды в одной пробирке заливают стерильным расплавленным парафином, смесью вазелинового масла и парафина (1:1), или водным агаром (1,5 г агара на 100 мл), слоем 1—2 см.

Продолжительность культивирования от 2 до 7 суток. По окончании опыта регистрируют изменение рН среды по перемене цвета индикатора. Аэробные микроорганизмы, осуществляющие дыхание и не способные к брожению, растут на поверхности среды только в пробирке без парафина и образуют небольшое количество кислот лишь в верхнем слое среды. В случае нейтрализации этих кислот продуктами разложения пептона в поверхностном слое среды наблюдается щелочная реакция. Микроорганизмы, способные сбраживать углеводы, растут и образуют кислоты в обеих пробирках, но кислотность в анаэробных условиях значительно выше, чем в первом варианте. Это хорошо заметно по изменению цвета индикатора. Если брожение сопровождается образованием газов, то происходит разрыв агаризованной среды.

9.2.5. Определение внеклеточных ферментов

Как указывалось выше, некоторые микроорганизмы способны использовать в качестве питательных субстратов самые различные высокомолекулярные соединения: полисахариды, белки, нуклеиновые кислоты, липиды и др. Однако макромолекулы не могут проникать через мембрану клетки. Они подвергаются расщеплению, которое осуществляется под воздействием экзоферментов„ относящихся к классу гидролаз. Большинство из них катализирует гидролиз полимера до растворимых продуктов, обычно диме-ров или мономеров, которые поступают в клетку с помощью специфических транспортных механизмов. Образование экзофермен-тов широко распространено среди различных групп микроорганизмов. При поиске продуцентов ферментов-гидролаз в лабораторной практике применяют специальные методы. Сущность их состоит в следующем. Микроорганизмы выращивают на агаризованной среде, содержащей макромолекулярный субстрат. Если клетки выделяют в среду экзоферменты, гидролизующие данное соединение, то выросшие колонии окружены зоной, в которой обнаруживаются продукты гидролиза.

Амилолитическая активность. Крахмал подвергается гидролитическому расщеплению под действием амилаз, активными продуцентами которых являются различные виды бацилл, псевдомонад, стрептомицетов и мицелиальных грибов. Для выявления амилоли-тической активности часто используют среду следующего состава (г/л): пептон — 10,0; КН2РО4 — 5,0; растворимый крахмал — 2,0; агар — 15,0, рН среды 6,8—7,0. Среду стерилизуют при 1 ати и разливают в стерильные чашки Петри. Когда среда застынет, исследуемые микроорганизмы высевают штрихом по диаметру чашки или уколом. Продолжительность культивирования 2—10 суток.' Ги