Биологический каталог




Руководство к практическим занятиям по микробиологии

Автор М.Н.Пименова, Н.Н.Гречушкина, Л.Г.Азова, А.И.Нетрусов и др.

дролиз крахмала обнаруживают после обработки агаровой пластинки раствором Люголя (приготовление реактива см. Приложение). Для этого на поверхность среды наливают 3—5 мл раствора Люголя. Среда, содержащая крахмал, окрашивается в синий цвет, а зона гидролиза остается бесцветной или приобретает красно-бурую окраску, если крахмал гидролизовался до декстринов. Зону гидролиза крахмала измеряют в миллиметрах от края штриха (колонии) до границы светлой зоны. Чем больше диаметр светлой зоны, тем выше амилолитическая активность (рис. 66).

Протеолитическая активность. Протеолитические ферменты

(протеазы) катализируют расщепление белков на поли- н олиго-пептиды. Протеазы выделяются различными видами бацилл, актиномицетов, мицелиальных грибов и другими микроорганизмами.

а

Рис 66 Определение амилолитической активности: а — схема посева (/—4 — штрихи разных культур); б — среда с культурами после обработки раствором люголя

Активность внеклеточных протеаз определяют, используя в качестве субстрата желатину, казеин или другие белки.

Протеолиз желатины. Микроорганизм высевают на мя-со-пептонную желатину (МПЖ). Ее готовят следующим образом. К 100 мл МПБ добавляют 10—15 г желатины, оставляют на 20— 30 мин, чтобы желатина набухла, затем смесь нагревают на водяной бане до полного растворения желатины и разливают полученную МПЖ в пробирки по 8—10 мл. Стерилизуют при 0,5 ати 15 мйи. Посев проводят уколом. Продолжительность культивирования 7—10 суток при комнатной температуре. Разжижение желатины или его отсутствие отмечают визуально. Если желатина разжижается, указывают интенсивность и форму разжижения — послойное, воронкообразное, мешковидное, пузыревидное и т. д. <рис. 67).

Протеолиз казеина. Для выявления этой способности используют молочный агар — среду, состоящую из равных частей стерильного обезжиренного молока и стерильного 3%-ного водного агара. Как правило, перед приготовлением среды молоко обезжиривают центрифугированием в течение 15 мин при 2—3 тыс. об/мин. Жиры, которые образуют на поверхности молока достаточно плотную пленку, удаляют, а молоко стерилизуют при 0,5 ати. После стерилизации его подогревают и добавляют при постоянном перемешивании к стерильному расплавленному и остуженному до 50° водному агару. Полученную среду разливают в чашки Петри. Микроорганизмы высевают штрихом по диаметру чашки или уколом. Продолжительность культивирования 2—10 суток. Гидролиз казеина обнаруживают по зоне просветления среды вокруг колонии или выросших по штриху микроорганизмов. Особенно четко она видна после обработки среды раствором 5%-ной трихлоруксусной кислоты. Зону гидролиза казеина измеряют в мм от края штриха или колонии до границы светлой зоны. Чем больше диаметр светлой зоны, тем выше казеинолитическая активность бактерий.

Липолитическая активность. Липиды подвергаются гидролитическому разложению под действием липаз. Продуценты липаз обнаружены среди дрожжей, мицелиальных грибов, бактерий рода Clostridium и других микроорганизмов. Для выявления липолити-ческой активности исследуемые микроорганизмы высевают на среду, содержащую соответствующий липид. Определенная трудность при постановке таких опытов связана с тем, что жиры не смешиваются с водой. Поэтому чаще всего вместо жиров в среду вводят твины — эфиры жирных кислот и сорбита. Твин-40 содержит пальмитиновую, твин-60 — стеариновую, а твин-80 — олеиновую кислоты. Твины хорошо растворимы в воде и имеют нейтральную реакцию. Состав среды (г/л): твин — 10,0; пептон — 10,0; NaCl — 5,0; СаС12Н20 — 0,1; агар — 20,0; рН среды 7,4. Готовят среду без твина и стерилизуют ее при 1 ати. Водный раствор твина соответствующей концентрации стерилизуют отдельно при 0,5 ати и добавляют к стерильной основной среде. Среду разливают в чашки Петри. Когда агар застывает, на поверхность агаровой пластинки высевают штрихом или уколом исследуемый микроорганизм. Засеянные чашки Петри выдерживают при соответствующей температуре необходимое для роста микроорганизма время. На наличие липазы указывает образование вокруг штриха или колонии непрозрачной зоны кальциевых солей жирных кислот, освобожденных из твина.

9.2.6. Образование антибиотиков

В процессе жизнедеятельности многие микроорганизмы образуют специфические продукты, которые обладают высокой физиологической активностью по отношению к другим микроорганизмам или вирусам, задерживая их рост или убивая их. Они называются антибиотиками. В отличие от общебиологических ядов ан» тибиотики проявляют свое действие лишь по отношению к отдельным, вполне определенным видам или группам микроорганизмов. Одни антибиотики — пенициллин, фумагиллин, бацитрацин и др. — подавляют рост ограниченного числа видов микроорганизмов. Другие — тетрациклины, хлорамфеникол, эритромицин,, карбомицин — имеют широкий спектр действия, т. е. подавляют рост многих грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также риккетсий и некоторых вирусов. Как правило, грамположи-тельные бактерии более чувствительны к действию антибиотиков по сравнению с грамотрицательными, что связано со строением их клеточной стенки. Наиболее часто активные продуценты антибиотических веществ встречаются среди стрептомицетов, спорообра-зующих бактерий и мицелиальных грибов.

Определение антибиотической активности микроорганизмов.

Существуют различные способы выявления антибиотических свойств микроорганизмов. Многие из них основаны на способности антибиотиков диффундировать в агаризоваиные среды и образовывать зоны, в которых не растут тест-организмы. Величина зоны отсутствия роста указывает на степень активности данного антибиотика в отношении тест-культуры и зависит от его концентрации, а также от плотности культуры тест-организма, состава и толщины слоя агаризованной среды, температуры инкубации, длительности диффузии и других факторов. В качестве тест-организмов используют представителей различных микроорганизмов, в первую очередь Escherichia coli (грамотрицательные бактерии), Staphylococcus aureus (грамположительные бактерии), Bacillus subtilis или Bacillus mycoides (спорообразующие бактерии), дрожжи рода Candida или Saccharomyces. При необходимости этот стандартный набор тест-организмов дополняют другими микроорганизмами. Антибиотическую активность чаще всего выявляют методами перпендикулярных штрихов и агаровых блочков.

Метод перпендикулярных штрихов. На питательный агар в чашке Петри высевают штрихом предполагаемый продуцент антибиотического вещества. Посев штрихом делают по дна-метру чашки Петри. Время инкубации продуцента зависит от скорости его роста. После того как продуцент вырастет и образует антибиотическое вещество, диффундирующее в толщу агара, перпендикулярно к его штриху подсевают штрихами тест-организмы,, начиная от штриха к периферии чашки. Для посева используют густые суспензии тест-организмов в стерильной водопроводной воде. Чашки выдерживают в термостате при 18—30° в течение-2—8 суток в зависимости от скорости роста тест-организмов. Нечувствительные к антибиотическому веществу тест-организмы растут вблизи штриха продуцента. Если антибиотик оказывает действие на тест-организм, то рост последнего будет наблюдаться вдали от штриха продуцента (рис. 68). Чем больше это расстояние, тем более чувствительным является тест-организм к антибиотическому веществу, образуемому изучаемым продуцентом.

Метод имеет, однако, существенный недостаток. Продуцент антибиотического вещества и тест-организм выращивают на одной среде, хотя известно, что не всегда одна и та же среда одинаково благоприятна как для продуцента и образования им антибиотика, так и для роста тест-организма.

Метод агаровых блочков предусматривает использование разных питательных сред для выращивания продуцента антибиотика и тест-организмов. Для выявления антибиотических свойств актиномицетов предполагаемый продуцент выращивается на среде следующего состава (г/л): глюкоза — 30,0; KNO3 — 5,5; MgS04 — 0,5; NaCl — 1,0; К2НРО4 — 0,4; ZnS04 — 0,002; FeS04 — 0,002; агар — 25,0; вода дистиллированная; рН 7,1—7,2. Среду стерилизуют при 0,5 ати и разливают в стерильные чашки Петри. После застывания агара продуцент антибиотического вещества высевают сплошным газоном. Для этого споры актиноми-цета переносят петлей на агаровую пластинку, распределяют по всей поверхности шпателем и инкубирует при 28—30° в течение 8—10 суток. Затем стерильным пробочным сверлом (диаметр 6-8 мм) вырезают агаровые блочки с газоном актиномицета и переносят их на поверхность агаризованной среды, например МПА, только что засеянной тест-организмом. Агаровые блочки раскладывают по шаблону на равном расстоянии один от другого и на расстоянии 1,5—2 см от края чашки мицелием вверх и плотно прижимают к агаровой пластинке. Для лучшей диффузии антибиотических веществ в толщу питательной среды, засеянной тест-организмом, блочки можно закладывать непосредственно в лунки, предварительно вырезанные тем же сверлом. На одной чашке Петри с тест-организмом можно разместить 5—6 агаровых блочков с разными продуцентами антибиотиков (рис. 69). Чашки выдержива

а

Рис 69. Определение антибиотической активности методом

агаровых блочков а — схема постановки опыта (1—4 — блочки с разными продуцентами); б — зоны подавления роста тест-культуры под действием антибиотика, диффундирующего в агар блочков

ют 1 ч при комнатной температуре для диффузии антибиотических веществ в толщу агара, затем помещают в термостат при температуре, благоприятной для развития тест-организма на сутки и более в зависимости от скорости его роста. Если тест-организм чувствителен к антибиотическому веществу продуцента, то после инкубации вокруг агаровых блочков образуются зоны отсутствия его роста. Чем больше выделяется антибиотика и чем он активнее, тем больше будет диаметр зоны отсутствия роста тест-организма. Тест-организм, не чувствительный к антибиотическому веществу данного продуцента, растет по всей поверхности среды и даже вблизи блочка продуцента.

Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотическим веществам. Чувствительность микроорганизмов к антиби

страница 36
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46

Скачать книгу "Руководство к практическим занятиям по микробиологии" (2.03Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.09.2019)