у Петри. Чтобы исключить, эффект экранирования, следует использовать суспензии с концентрацией не выше 5Т08 клеток/мл и проводить облучение в буферных растворах. Летальный эффект УФ-лучей зависит от физиоло* гического состояния клеток, прежде всего от их возраста. Обычна в фазе экспоненциального роста культуры клетки более чувствительны к УФ-лучам, чем в стационарной фазе. Кроме того, облучение и дальнейшую инкубацию клеток микроорганизма следует проводить в условиях, исключающих фотореактивацию, т. е. в темноте.

Нитрозогуанидин. Ы-метил^Ч-нитро-Ы-нитрозогуанидин (НГ)

является одним из самых мощных и широко применяемых мутагенов. Исходные растворы НГ готовят непосредственно перед использованием, растворяя его в соответствующем буфере (например, 0,1 М нитратный буфер, рН 5,5) до концентрации 1 мг/мл. Рабочая концентрация НГ составляет обычно 50—500 мкг/мл. Клетки (обычно из 5 мл культуры в экспоненциальной фазе роста) осаждают центрифугированием, промывают равным объемом нитратного буфера, ресуспендируют в 5 мл буфера, добавляют НГ и инкубируют при 30—37° в течение определенного времени. Время обработки подбирают предварительно таким образом, чтобы выживаемость клеток составляла примерно 50%. Клетки обрабатывают НГ в конечной концентрации 50—100 мкг/мл в течение 30 мин. Обработанные клетки осаждают центрифугированием, промывают фосфатным буфером (рН 7,0) или минимальной средой (см. Приложение), чтобы удалить НГ. После этого клетки переносят в богатую питательную среду (см. Приложение) и инкубируют в течение ночи (12—16 ч).

~ Таблица 13

Свойства некоторых мутагенов, используемых для индукции мутаций у микроорганизмов

Мутаген Механизм действия Тип мутации Эффективность Характерные особенности

1 2 3 4 5

Радиация

Рентгеновское излучение, быстрые нейтроны преимущественно разрывы хромосомы делеции, инверсии средняя требует специального оборудования

Уф-облучение димеризация пирими-динов транзиции, трансверсии, делеции средняя высокая частота индукции мутаций достигается только в условиях низкой выживаемости: фотореактивация должна быть предотвращена

Химические агенты

Аналоги оснований: 2-аминопурин, 5-брому-рацил ошибки в репликации ДНК транзиции низкая слабый мутаген

Гидроксиламин дезамннирование цитозина транзиции низкая те же

Азотистая кислота дезамннирование цитозина и аденина транзиции, делеции средняя высокая частота мутаций достигается только в условиях низкой выживаемости

Нитрозогуаиидин алкилирование оснований в репликационной вилке транзиции, трансверсии, с низкой частотой делеции очень высокая опасен в обращении, высокая частота вторичных мутаций

Азотистая кислота. Раствор азотистой кислоты готовят непосредственно перед использованием, растворяя нитрат натрия в 0,1 М Na-ацетатном буфере (рН 4,6) до конечной концентрации 0,05 М.

Алкилирующие агенты. Из алкилирующих соединений в качестве мутагена наиболее широко используют этилметансульфонат (ЭМС). Клетки (обычно из 5 мл культуры в поздней экспоненциальной фазе роста) осаждают центрифугированием и ресуспендируют в 2 мл минимальной питательной среды без источника углерода, содержащей 0,2 М трис-НС1(рН 7,5). К суспензии клеток добавляют 0,03 мл ЭМС, энергично перемешивают до его полного растворения и инкубируют при 30—37° в течение 1—2 ч (желательно на качалке). Затем к суспензии клеток добавляют 10—15 мл минимальной или богатой питательной среды и инкубируют в течение ночи.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С МУТАГЕНАМИ

Физические и химические мутагены не только увеличивают частоту мутаций: многие из них обладают канцерогенным действием, способным вызвать опухоли у млекопитающих. Кроме того, химические мутагены при попадании на кожу или внутрь могут привести к ожогам и отравлению.

При работе с мутагенами следует строго соблюдать следующие правила:

1. Любую работу с химическими мутагенами необходимо проводить в вытяжном шкафу, рабочая поверхность которого застелена фильтровальной бумагой.

2. Руки должны быть защищены резиновыми или пластиковыми перчатками.

3. Растворы мутагенов нельзя засасывать ртом; следует использовать автоматические пипетки или пипетки с резиновой грушей.

4. Растворы мутагенов нельзя сливать в раковину; лучше пропитать ими соответствующие твердые материалы (такие, как вермикулит) и поместить в герметичный контейнер, подобно другим опасным отходам.

Клетки (обычно из 5 мл культуры в экспоненциальной фазе роста) осаждают центрифугированием, промывают равным объемом Na-ацетатного буфера, ресуспендируют в 1 мл раствора азотистой кислоты и инкубируют при 30—37° в течение определенного времени. Время обработки подбирают предварительно таким образом, чтобы выживаемость клеток составляла 0,01—0,1%. Клетки обрабатывают азотистой кислотой в течение 10—20 мин. После окончания инкубации к клеткам добавляют 5—10 мл минимальной среды, чтобы остановить реакцию. Затем клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 10 мл богатой питательной среды и выращивают в течение ночи.

5. При работе с источниками УФ-лучей следует защищать глаза стеклянными очками.

10.2.4. Экспрессия мутаций

У микроорганизмов в экспоненциальной фазе роста культуры скорость деления хромосомы (у бактерий) или ядер (у эукарио-тических клеток) обычно опережает скорость деления клеток. Поэтому для проявления возникших мутаций, большинство из которых являются рецессивными, необходим так называемый сегрегационный лаг-период, в течение которого происходит образование клеток, содержащих только мутантные хромосомы или ядра. Кроме того, для проявления некоторых мутаций необходим дополнительный фенотипический лаг-период. Например, для проявления мутаций устойчивости к фагу у Е. сок необходимо, чтобы все рецепторы клеточной стенки заменились на мутантные. Это происходит только после двенадцати дополнительных делений. В связи с этим суспензию клеток микроорганизма, обработанную мутагеном, необходимо подрастить в течение определенного периода времени. Длительность этого периода зависит как от скорости деления клеток, так и от специфики роста. Например, для микроорганизмов, клетки которых при росте образуют цепочки или гроздья, этот период больше, чем для штаммов, растущих в виде одиночных клеток.

Таким образом, после подращивания клеток не все мутанты, которые обнаруживаются в культуре, являются независимыми, т. е. часть мутантных клеток происходит от одной исходной мутантной клетки в результате ее размножения. Поэтому, чтобы получить ряд независимых мутантов, культуру после обработки мутагеном необходимо разделить на ряд субкультур и из каждой субкультуры отбирать только по одному мутанту.

10.3. ОТБОР МУТАНТОВ

10.3.1. Прямой отбор мутантов

Использование селективных сред, т. е. сред, на которых способны расти клетки только определенного фенотипа, позволяет в ряде случаев проводить прямой отбор мутантов. К таким мутантам относятся клетки, приобретшие устойчивость к какому-либо веществу, например, антибиотику, токсичному соединению или фагу. Во всех этих случаях селективная среда должна содержать соответствующую добавку (например, антибиотик), подавляющую рост клеток дикого типа. Кроме того, прямым отбором могут быть выделены мутанты, способные к утилизации нетрадиционных источников углерода или азота. В данном случае, наоборот, в селективной среде должен отсутствовать какой-либо фактор, необходимый для роста клеток дикого типа.

Существенной особенностью при прямом отборе мутантов является выбор оптимальной концентрации селективного агента, в которой он подавляет рост клеток дикого типа, но в то же время позволяет расти устойчивым к ним мутантам. Поэтому предварительно рекомендуется определить кривую выживаемости клеток в зависимости от концентрации селективного.агента.

С помощью селективных сред можно также отбирать клетки-ревертанты, т. е. клетки, у которых в результате обратных мутаций, истинных или супрессорных, произошло восстановление свойств штамма дикого типа. Метод прямого отбора обладает высокой чувствительностью, поскольку позволяет выявлять редкие мутантные клетки на фоне немутировавших клеток.

10.3.2. Непрямой отбор мутантов

Использование индикаторных сред. Индикаторные среды, т. е. среды, на которых колонии микроорганизма с разными фенотипами отличаются по внешнему виду, широко используются в генетике микроорганизмов, в частности, для непрямой селекции мутантов. Они позволяют различать фенотипы по цвету колоний. Индикаторные среды бывают двух типов: с индикаторами на использование веществ и с хромогенными субстратами.

Среды с индикаторами на использование веществ содержат какой-либо углевод (например, лактозу) и индикатор (хлорид трифенилтетразолия, эозин-метиленовый синий, индикатор Мак-Конки и другие), меняющий свой цвет в зависимости от рН среды.

На среде с лактозой и трифенилтетразолием клетки Е. coll, использующие лактозу, образуют кислоты и понижают рН среды. При низких значениях рН восстановления трифенилтетразолия не происходит и колонии имеют нейтральный или белый цвет. Колонии, состоящие из клеток, не способных использовать лактозу, имеют ярко-красную окраску. Напротив, на среде с индикатором Мак-Конки, содержащей лактозу, колонии, клетки которых способны использовать ее, приобретают темно-красный цвет. Клетки, не способные использовать лактозу, образуют колонии белого цвета.

Применение индикаторных сред пригодно для поиска любых мутантов, если имеется возможность различать колонии мутантов по изменению их окраски. С помощью индикаторных сред можно, например, выявлять мутанты по фосфатазной, нуклеазной или протеолитической активности.

Важной особенностью метода индикаторных сред является подбор оптимального разведения культуры при посеве на агаризоваиные среды. Количество колоний на чашке не должно быть слишком большим (обычно не более 100), иначе фенотипы соседних колоний (например, из-за подкисления среды) могут быть выражены нечетко.

Среды с хромогенными субстратами содержат специальные субстраты, разлагающиеся с образованием красителя при их гидролизе определенными фер