Биологический каталог




Руководство к практическим занятиям по микробиологии

Автор М.Н.Пименова, Н.Н.Гречушкина, Л.Г.Азова, А.И.Нетрусов и др.

пешного развития молекулярной биологии и привело к возникновению геносистематики. Исследование генотипа, основанное на анализе нуклеиновых кислот, в принципе дает возможность построить со временем естественную (филогенетическую) систему микроорганизмов. Филогенетические взаимоотношения бактерий оценивают определением содержания ГЦ в ДНК, ДНК—ДНК и ДНК—рРНК гибридизацией, с помощью ДНК-зондов, а также изучением последовательности нуклеотидов в 5S, 16S и 23S рРНК ^см. гл. 8).

Молекулярное содержание ГЦ от общего количества оснований ДНК у прокариот, как уже указывалось, колеблется от 25 до 75%. Каждый вид бактерий имеет ДНК с характерным средним содержанием ГЦ. Однако поскольку генетический код вырожден, а генетическое кодирование основано не только на содержании нуклеотидных оснований в единицах кодирования (триплетах), но и на их взаимном расположении, то одинаковое среднее содержание ГЦ в ДНК двух видов бактерий может сопровождаться их значительным генотипическим разделением. Если два организма очень блцзки по нуклеотидному составу ДНК, то это может являться свидетельством их эволюционного родства только при условии, что они обладают большим числом общих фенотипических признаков или генетическим сходством, подтвержденным другими методами. В то же время расхождение (более 10—15%) в нуклеотидном составе ДНК двух штаммов бактерий с общими фенотипическими свойствами показывает, что они относятся по крайней мере к разным видам.

Метод ДНК—ДНК гибридизации является более важным для оценки генетического родства бактерий. При тщательном проведении экспериментов можно получить ценную информацию о степени их генетической гомологии. Внутри одного вида бактерий степень генетической гомологии штаммов достигает 70—100%. Однако если в результате эволюционной дивергенции последовательности нуклеотидных оснований геномов двух бактерий различаются в большей степени, то специфическая реассоциация ДНК— ДНК становится такой слабой, что не поддается измерению. В таком случае гибридизация ДНК—рРНК позволяет значительно увеличить круг организмов, у которых можно определить степень генетической гомологии благодаря тому, что на относительно небольшом участке бактериального генома, кодирующем рибосом-ные РНК, исходная последовательность оснований сохраняется значительно полнее, чем на других участках хромосомы. В итоге методом ДНК—рРНК гибридизации часто обнаруживают довольно высокую гомологию геномов бактерий, у которых реассоциация ДНК—ДНК не выявляет заметной гомологии.

Для идентификации бактерий иногда используют также метод ДНК-зондов (генных зондов), являющийся разновидностью метода молекулярной гибридизации ДНК—ДНК. Реакция гибридизации ведется в этом случае не между двумя препаратами тотальной ДНК» а между фрагментом нуклеотидной последовательности ДНК (зондом), включающим ген (генетический маркер), ответственный за какую-то определенную функцию (например, устойчивость к какому-нибудь антибиотику), и ДНК изучаемой бактерии. Самым распространенным способом создания генных зондов является выделение специфических фрагментов путем молекулярного клонирования. Для этого вначале создают «банк генов» изучаемой бактерии расщеплением ее ДНК эндонуклеазами рестрикции, а затем отбирают нужный клон из суммы фрагментов ДНК методом электрофореза с последующей проверкой генетических свойств этих фрагментов методом трансформации. Далее выбранный фрагмент ДНК с помощью фермента лигазы вводят в состав подходящей плазмиды (вектора), а эту комбинированную плазмиду вводят в удобный для работы штамм бактерий (например, Escherichia coli). Из биомассы бактерии, несущей ДНК-зонд, выделяют плазмидную ДНК и метят ее, например, радиоизотопной меткой. Затем осуществляют гибридизацию ДНК зонда с ДНК бактерии. Образовавшиеся гибридные участки проявляют методом ауторадиографии. По относительной частоте гибридизации генетического маркера с хромосомой той или иной бактерии делают заключение о генетическом родстве этих бактерий с исследуемым штаммом.

Однако наиболее широкое распространение и значение для идентификации бактерий и создания филогенетической системы их классификации получил метод анализа нуклеотидных последовательностей в рибосомальных РНК. Молекулы 5S, 1GS и 23S рРНК содержат участки с самой высокой степенью генетической стабильности. Считают, что они находятся вне механизма действия естественного отбора и эволюционируют только в результате спонтанных мутаций, происходящих с постоянной скоростью. Так как накопление мутаций зависит только от времени, то информация о нуклеотидной последовательности этих молекул является наиболее объективной для определения филогенетического родства организмов на уровне от подвида до царства. В случае анализа 5S рРНК обычно определяют полную последовательность нуклеотидных последовательностей, которая в этой молекуле у прокариот составляет 120 нуклеотидов. При исследовании 16S и 23S рРНК, содержащих 1500 и 2500 нуклеотидов соответственно, часто проводят анализ олигонуклеогидов, полученных из этих молекул с помощью специфических эндонуклеаз рестрикции. Наиболее широкое распространение получило изучение последовательности олигонуклеотидов в 16S рРНК. Изучение структуры 16S рРНК представителей разных бактерий привело к выявлению среди прокариот группы архебактерий. Значения коэффициента сходства Sab, отделяющие 16S рРНК эубактерий и архебактерий, лежат в пределах 0,1, в то время как значение 5дп, равное 1,0, соответствует полной гомологии нулеотидных последовательностей, а 0,02 — уровню случайного совпадения.

Все чаще для идентификации бактерий предлагают дендро-граммы, показывающие взаимоотношения между бактериальными родами, видами или штаммами на основании изучения последовательности нуклеотидов (или олигонуклеотидов) в рРНК, а также ДНК—ДНК и ДНК—рРНК гибридизации. Однако различия в темпе эволюции у разных групп организмов, а также трудоемкость и дороговизна этих методов, не дают возможность использовать только филогенетический подход для систематики бактерий. Более того, идентификация бактерий до родов на основании только генетических методов без предварительного изучения их фено-типических характеристик часто вообще невозможна. Поэтому лучшим подходом в работе по систематике бактерий является изучение как генотипических, так и фенотипических свойств. В случае несоответствия между филогенетическими и фенотипическими данными приоритет временно отдают последним.

Идентификацию бактерий проводят обычно с помощью определителя Берги (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology). Первое издание этого пособия было осуществлено в 1923 г. под руководством известного американского бактериолога Д. Берги (D. Н. Bergey, 1860—1937). С тех пор оно регулярно переиздается с участием ведущих ученых-микробиологов мира. В последнем, 9-м издании Определителя Берги (1993), все бактерии разделены на 35 групп по легко определяемым фенотипическим признакам. Эти признаки вынесены в названия групп. Таксономическое положение бактерий внутри групп определяется с помощью таблиц и ключей, составленных на основе небольшого числа фенотипичес-ких признаков.

Более полная информация о таксономическом положении бактерий содержится в 4-томном Руководстве Берги по систематике бактерий (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 1984— 1989). Для каждой группы бактерий дается описание входящих в него родов и видов, в том числе с неясным таксономическим статусом. Помимо подробного фенотипического описания, включающего морфологию, организацию и химический состав клеток, антигенные свойства, вид колоний, особенности жизненного цикла и экологии, в характеристике родов приводятся также сведения о содержании ГЦ в ДНК, результатах гибридизации ДНК—ДНК и ДНК—рРНК. Ключи и таблицы позволяют идентифицировать бактерии не только до рода, но и до вида.

Помимо определителя Берги имеется ряд статей и книг, в которых предлагаются оригинальные ключи для идентификации отдельных групп бактерий, например бацилл, псевдомонад, актиномицетов, энтеробактерий. Для иллюстрации приведем схему идентификации некоторых видов бацилл (табл. 14) К

Окончание табл. 14

13. Ширина клеток 10 мкм и больше

14. рН в среде для образования ацетоина меньше 6,0

15. Рост в анаэробном агаре

16. Кислота на среде с глюкозой

17. Рост при 65°

18. Гидролиз казеина

19. Параспоральные тельца

да ...... В. megaterium нет . 14да Вч circulans нет . . . В. firmus есть В. laterosporus нет . 16 есть . В. Ъrevis нет В. sphaericus есть ... В. stearothermophilus нет . 18 есть ...... В. larvae нет 19 есть В. popilliae

нет ...... В. lentimorbus

Следует отметить, что для описания новых штаммов бактерий изучают, как правило, больше признаков, чем необходимо для их идентификации, так как ключи и таблицы включают не все признаки идентифицируемых бактерий, а только те, которые отличаются у разных видов (табл. 15).

Таблица 15

Минимальный перечень данных, необходимых для описания новых штаммов бактерий (по Truper, Schleifer, 1992)

Свойства Основные признаки Дополнительные признаки

Морфология клеток форма, размер; подвижность; внутриклеточные и внеклеточные структуры; взаимное расположение клеток; клеточная дифференцнров-ка; тип клеточного деления; ультраструктура клетки цвет; характер жгутикова-ния; споры капсулы, чехлы, выросты; жизненный цикл, гетероцисты, гормогоиии; ульстраструктура жгутиков, оболочки, клеточной стенки

Характер роста особенности роста на плотных и в жидких питательных средах; морфология колоний. цвет колоний, суспензии

Окраска по Граму на кислотоустойчивость, окраска спор, жгутиков

Состав клетки состав ДНК; запасные вещества гомология нуклеиновых кислот; клеточные пигменты; состав клеточной стенки; типичные ферменты

ПРИЛОЖЕНИЕ

СРЕДЫ для КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РАЗЛИЧНЫХ

МИКРООРГАНИЗМОВ

Среды, обеспечивающие рост различных хемоорганогетеротрофных бактерий

1. Мясо-пептонный бульон.

2. 4—8 °Б сусло.

3. Среда состава (г): пептон — 10,0; дрожжевой экстракт — 1,0; глюкоз

страница 43
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46

Скачать книгу "Руководство к практическим занятиям по микробиологии" (2.03Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(01.04.2020)