ищевых продуктов используют различные виды излучений: инфракрасное, ультрафиолетовое, рентгеновские лучи, а-, р1- и ч~лучи радиоактивных элементов. Чаще других в микробиологической практике используется ультрафиолетовое облучение. Мощность ультрафиолета измеряется в бактах. Доза УФ-излучения, губительная для различных видов микроорганизмов (кроме спор), составляет 5 мкб/см2.

Основные способы стерилизации питательных сред, посуды и других лабораторных материалов обобщены в табл. 6.

Следует отметить, что все большее распространение получают посуда и инструменты одноразового использования.

Таблица 6

Способы стерилизации питательных сред, посуды и других лабораторных материалов

Стерилизуемый материал

Метод стерилизации

Режим стерилизации

Примечание

Питательные среды с почвенной вытяжкой; картофельные и некоторые другие натуральные среды

автоклавирование

1,5—2 атн, 30 мин

в колбах, пробирках, бутылях и т д, закрытых ватными пробками

Жидкие и агаризоваиные среды, не содержащие Сахаров и других веществ, разлагающихся при 120°

Жидкие и агаризоваиные среды, с сахарамн и другими соединениями, не выдерживающими нагревания прн 12(г

Среды нли компоненты среды, не выдерживающие нагревания выше 100°

автоклавирование

автоклавирование

дробная стерилизация

1 атн, 20 мии

0,5 атн, 15—30 мин

текучий пар,

3 раза по 30—40 мин через сутки

то же

то же

то же

Среды или компоненты сред, не выдерживающие нагревания, например, белки, некоторые витамины и аминокислоты

Вазелиновое масло, глицерин, тальк

Чашки Петрн, пнпетки, шпатели

Колбы, пробирки, химические стаканы, флаконы, стеклянные центрифужные пробирки, трубки Бурри

фильтрование через бактериальные фильтры

горячим воздухом

горячим воздухом

горячим воздухом

160°, 2 ч или 170°, 1 ч

160—170°, 2 ч

160—1/0°, 2 ч

слой вещества в сосуде не должен превышать 1,5 см

завернуты в бумагу (отверстия пипеток закрыты ватными тампонами)

закрыты аатньын пробками

ГЛАВА 4

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

Культивирование микроорганизмов является одним из основных методов микробиологии. От умения культивировать микроорганизмы в лабораторных условиях в значительной степени зависят успехи их изучения и практического применения. Культивирование основано на знании физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов и понимании значения физико-химических условий среды, необходимых для их жизнедеятельности.

4.1. ПРИНЦИПЫ СОСТАВЛЕНИЯ СРЕД ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

В лабораторных условиях микроорганизмы культивируют на питательных средах, поэтому питательная среда должна содержать все вещества, необходимые для их роста. Предложены сотни различных сред для культивирования микроорганизмов, состав которых определяется потребностями микроорганизмов в соединениях, необходимых для биосинтеза и получения энергии. Конструктивные и энергетические процессы у микроорганизмов крайне разнообразны, поэтому столь же разнообразны их потребности в питательных веществах. Йз этого следует, что универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов, не существует.

Основными компонентами любой питательной среды для культивирования микроорганизмов являются соединения углерода и азота. И именно эти соединения определяют специфичность подавляющего большинства питательных сред.

По потребностям в углероде микроорганизмы принято делить на две большие группы — автотрофы и гетеротрофы. Автотроф-ные микроорганизмы способны в качестве единственного источника углерода использовать углекислоту — соединение, содержащее углерод в наиболее окисленной форме. В соответствии с этим при культивировании автотрофов необходимо обеспечить клетки углекислотой, так как концентрация углекислоты в воздухе не превышает 0,03% и ее поступления в среду за счет диффузии недостаточно для интенсивного роста микроорганизмов. Поэтому в среды для культивирования автотрофов вносят бикарбонат натрия (ЫаНСОз) или карбонаты, чаще всего углекислый кальций (СаСОз). В некоторых случаях через среду продувают воздух, обогащенный 1—5% углекислоты.

Потребности гетеротрофных микроорганизмов не могут быть удовлетворены только углекислотой. Для их развития среда должна содержать органические соединения. В зависимости от индивидуальных особенностей микроорганизмы-гетеротрофы способны использовать различные соединения углерода — кислоты, спирты, углеводы, углеводороды, ароматические соединения. При этом потребности некоторых микроорганизмов, например ряда бактерий из семейства Pseudomonadaceae, могут быть удовлетворены широким набором различных органических веществ, тогда как другие микроорганизмы характеризуются высокой специализацией и способностью использовать лишь немногие соединения углерода. Так, некоторые метанокисляющие бактерии используют только метан и метанол.

Вторым основным компонентом питательной среды является источник азота. Азот входит в состав органических веществ клетки главным образом в восстановленной форме — в виде амино (—NH2)- или имино (—NH)-групп. Тем не менее потребности микроорганизмов в источнике азота могут быть удовлетворены различными азотсодержащими соединениями, в которых азот имеет разную степень восстановленности. Для очень многих микроорганизмов это могут быть соли аммония. В этом случае в среды вносят NH4C1 или (NH4)2S04. Следует, однако, помнить, что аммонийные соли — физиологически кислые соли, так как по мере использования иона аммония в среде накапливается анион соответствующей кислоты, что приводит к заметному возрастанию кислотности среды и может отрицательно повлиять на развитие микроорганизмов.

Потребности значительного числа микроорганизмов в азоте Могут быть удовлетворены нитратами. Питательные среды для культивирования таких микроорганизмов содержат KNO3, или NaN03. В отличие от солей аммония нитраты — физиологически щелочные соли, так как при использовании аниона N0^ в среде накапливаются катионы К+ или Na+ Нитриты в кислых условиях для многих микроорганизмов токсичны, поэтому в качестве источника азота почти не используются.

Питательные среды для культивирования некоторых микроорганизмов должны включать одну, несколько или полный набор аминокислот. Отдельные аминокислоты в L- или DL-форме добавляют к стерильной среде в концентрации от 0,1 до 0,05 г на 100 мл непосредственно перед засевом ее микроорганизмами. Для этого рекомендуется использовать растворы аминокислот, в которых концентрация превышает содержание аминокислоты в среде в 100 раз. Глицин, аланин, лролин, лизин и орнитин растворяют в дистиллированной воде, фенилаланин и триптофан — в дистиллированной воде, подщелоченной NaOH, остальные аминокислоты — в дистиллированной воде, подкисленной НС1. Аминокислоты — цистин и цистеин, а также амиды — глутамин и аспарагин неустойчивы к нагреванию, поэтому их стерилизуют фильтрованием. Остальные аминокислоты можно стерилизовать при 0,5 ати в течение 15 мин.

Потребности микроорганизов в некоторых аминокислотах часто удовлетворяют, добавляя к среде гидролизат белка. Для получения гидролизатов используют белки животного (мясо, рыбу, желатину, казеин) или растительного (семена сои, подсолнечника) происхождения, а также клетки микроорганизмов (дрожжи, водоросли, бактерии). Гидролиз проводят с помощью протеолити-ческих ферментов или кипячением с минеральными кислотами либо с крепкими щелочами. Состав гидролизатов неодинаков и зависит от исходного субстрата, а также способа получения. Чаще других используют гидролизат казеина, который готовят в лаборатории, как правило, кислотным гидролизом. Для этого 20 г казеина заливают 200 мл воды, добавляют 10 мл концентрированной H2SO4 и выдерживают в автоклаве 4 ч при 1,5 ати. Однако при этом подвергается коррозии оборудование автоклава, поэтому чаще гидролизат казеина получают иначе. К 200 г казеина добавляют 280 мл 6 н. раствора НС1 и смесь кипятят с обратным холодильником 18 ч. Полученный гидролизат нейтрализуют 50%-ным раствором NaOH до JJH 7, фильтруют через бумажный фидьтр и стерилизуют при 0,5 ати 30 мин. Содержание аминного азота в гидролизате, полученном таким способом, составляет 700—1000 мг на 100 мл. Его добавляют к средам в таком количестве, чтобы концентрация по аминному азоту составляла 10—30 мг на 100 мл. Следует иметь в виду, что при кислотном гидролизе полностью разрушается триптофан, в достаточно большой степени цистеин и незначительно серии и треонин. Имеется готовый препарат гидролизата казеина. Его вносят в среды от 1,0 до 0,1 г на 100 мл в зависимости от потребностей микроорганизмов.

Наиболее требовательные микроорганизмы культивируют на питательных средах, содержащих белки или продукты их неполного расщепления — пептоны, представляющие собой смесь поли-и олигопептидов, аминокислот, органических азотных оснований, солей и микроэлементов. Пептоны получают в результате воздействия протеолитических ферментов на белки животного (мышечной белок, казеин) или растительного (белок соевой муки) происхождения. В отечественных лабораториях чаще всего используют ферментативный пептон, выпускаемый Семипалатинским заводом. Это гигроскопический порошок светло-желтого цвета, полностью растворимый ,в воде; 1%-ный раствор пептона имеет нейтральную или слабокислую реакцию. В питательные среды пептон добавляют от 1—2 до 20 г на 1 л.

Необходимо иметь в виду, что аминокислоты и пептон микроорганизмы могут использовать не только как источник азота, но и как источник углерода и энергии.

Некоторые бактерии способны использовать в качестве единственного источника азота молекулярный азот N2. Это азотфикса-торы. В среды для культивирования таких микроорганизмов соединений азота можно не вносить. Снабжение азотфиксаторов газообразным азотом осуществляется благодаря соприкосновению среды с воздухом или культивированию в атмосфере азота.

Многие микроорганизмы требуют наличия в среде так называемых факторов роста, к которым относятся витамины, пурины, пи-римидины и аминокислоты. Чтобы подчеркнуть потребность микроорганизмов в факторах роста, прин