олекулы в кольцевую путем сшивания взаимно комплементарных концов.

Метод выделения генов из ДНК с помощью рестриктаз имеет существенные недостатки (Л.Л.Киселев, 1984). Трудно подобрать рестриктазы, позволяющие вырезать из ДНК именно тот участок, который соответствует нужному гену. Наряду с интересующим геном фрагменты ДНК, как правило, включают лишние нуклеотидные последовательности, создающие помехи для

Рис. 4. Подготовка фрагмента ДНК (/аооператора Е. coli) к встраиванию в состав генетического вектора (плазмиды). (По Г. Бойеру и др., 1980)

использования гена. Рестриктаза может отщепить часть ну-клеотидной последовательности гена, в результате чего ген теряет функциональную полноценность.

Гены эукариотных организмов имеют сложное строение: включают кодирующие белок, значащие (экзоны) и промежуточные, незначащие участки (интроны). Первичная РНК, синтезированная на такой ДНК-матрице, подвергается модификации (сплайсингу), в результате чего участки, соответствующие интронам, удаляются, а участки, соответствующие экзонам, соединяясь, образуют зрелую матричную РНК- Наличие интронов является препятствием для нормального функционирования трансплантированных генов.

При обработке ДНК рестриктазами образуется смесь фрагментов. Непростая задача — выделить из этой смеси именно те фрагменты, которые несут нужный ген. Бактериальная клетка содержит около 5 тыс. генов, а эукариотная клетка — от 10 до 200 тыс. (К. Г. Газарян, В. 3. Тарантул, 1983).

Химико-ферментативный синтез генов. Этот метод — важная альтернатива «вырезанию» генов с помощью рестриктаз из нативной ДНК. Метод включает химический синтез коротких (8—16-звенных) одноцепочечных фрагментов ДНК (олигонукле-отидов) за счет поэтапного образования эфирных связей между нуклеотидами и сшивку олигонуклеотидов между собой посредством ДНК-лигазы с образованием двухцепочечных полинуклео-тидов.

Химико-ферментативный синтез позволяет точно воссоздать минимально необходимую последовательность нуклеотидов и избежать проблем, связанных с элиминированием лишних нуклеотидных последовательностей в фрагментах ДНК, в том числе интронов. Кроме того, имеется возможность введения в гены участков узнавания различных рестриктаз, регуляторных последовательностей и т. д.

Для химико-ферментативного синтеза генов необходима полная информация о его нуклеотидной последовательности, поэтому применимость метода ограничена возможностями получения такой информации. Последовательность нуклеотидов в гене может быть воссоздана на основе первичной структуры соответствующего белка. Триумф в анализе структуры гена — параллельное воссоздание нуклеотидной последовательности ДНК и цепочки аминокислотных остатков в кодируемом белке. Методом химико-ферментативного синтеза получены гены соматостатина, А- и В-цепей инсулина, проинсулина, /ас-оператор Е. coli и др.

Ферментативный синтез генов на основе выделенной из клетки матричной РНК (мРНК). Это наиболее популярный метод синтеза генов. Обратная транскриптаза (ревертаза) катализирует синтез нити ДНК, комплементарной мРНК. Полученную одно-цепочечную ДНК, называемую комплементарной ДНК или кДНК, используют в качестве матрицы для синтеза второй нити ДНК с применением ДНК-полимеразы или ревертазы. Преимущество рассматриваемого метода состоит в том, что ген получается без интронов и других нетранскрибируемых последовательностей. Помимо этого, легче создать условия, когда клетка аккумулирует нужный вид мРНК, чем отбирать ген из смеси фрагментов ДНК- Большим успехом в применении метода, основанного на РНК-зависимом синтезе ДНК, является получение в 1979 г. гена гормона роста человека (соматотропина).

Введение гена в вектор. Ген, полученный тем или иным способом, содержит информацию о структуре белка, но сам по себе не может реализовать эту информацию. Нужны дополнительные механизмы, управляющие действием гена, поэтому перенос генетической информации в клетку осуществляется в составе векторов. Векторы — это, как правило, кольцевые молекулы, способные к самостоятельной репликации. Ген вместе с вектором образует рекомбинантную ДНК.

Конструирование рекомбинантных ДНК осуществляется in vitro. Кольцевая молекула вектора размыкается рестриктазой. Необходимо, чтобы полученная линейная молекула ДНК содержала липкие концы, комплементарные концам вводимой ДНК. Комплементарные липкие концы вектора и вводимого гена сшивают ДНК-лигазой и полученную рекомбинантную ДНК с помощью той же ДНК-лигазы вновь замыкают с образованием единой кольцевой молекулы (рис. 5).

Различают два основных класса векторов: вирусы и плазмиды. Важной проблемой, возникающей при использовании вирусов в качестве генетических векторов, является их аттеньюа-ция — ослабление патогенности для хозяина, чтобы зараженные вирусом клетки выживали и могли передать потомству измененную генетическую программу. Большое значение для биотехнологии имеет способность вирусов быстро транспортироваться из клетки в клетку, распространяясь по растительной или животной ткани так