10 SO

GGAGU UCGACCG UGA CGAGUCACGGGCUAGCGCUUUCGCGCUCU GGGGUUCGCCCGGGGCGAACCCCGGGCGAACCCCUUCGCGAACC

90 100 110 120 130

CCAGGUGACGCCUCGUGA AGAGGCGCGACCUUCGUGCGUUUCGG CCGGGGGGGGCUUCGCGAAGGGGCCCCCCCUUCGUUCGUUUCGG

MO 150 160 170

CGACGCACGAGAACCGCCACGCUGCUUCGCAGCGUGGCCCUUCG CGAAGUUCGCGAACCCCUUCGCCCCUUCGCCCCGGGGCCCUUCG

1Й0 190 aoo 210

CGCAGCCCGCUGCGCGAGGUGACCCCCGAAGGGGGGUUCCCb CGAAC CCCC СUUCGCGAAGGGGCCC С СGAAGGGGGGGGCCCC

Рис. 57. Сопоставление последовательности миди-варианта Qp (по Спигелману и др.) с искусственной последовательностью, состоящей из блоков ССС(С) и UUCG и из комплементарных блоков GGG(G) и CGAA. Совпадение в 169 положениях из 218 позволяет предположить, что миди-вариант—это продукт, образованный de novo ферментом Qp-репликазэй, которая

имеет сайты узнавания для ССС(С) и UUCG (EF Ти). Кинетика синтеза de novo показывает, что в ферментативных сайтах узнавания образуется тетрамер, после чего происходит какое-то внутреннее самокопирование со случайными замещениями. Этот конкретный миди-вариант обычно выигрывает конкуренцию со всеми имеющимися последовательностями и поэтому является, вероятно, наиболее эффективной матрицей. Данный пример показывает, как в процессах примитивного копирования могут возникать однородные паттерны.

другом свои собственные затравки, которые она затем дуплицирует и избирательно усиливает, пока наконец не образуется однородная макроскопическая популяция последовательностей РНК с длиной несколько сотен нуклеотидов. В других условиях среды получаются другие (но тоже однородные) популяции последовательностей [8]. Спигелман, Миллз и их сотрудники определили последовательности нескольких таких «миди-вариантов», которые всегда содержат специфический сайт узнавания для Qp-репликазы [78]. Последующие эксперименты пролили свет на механизм этого синтеза de novo, показав, что небольшие фрагменты, соответствующие последовательностям, которые узнаются ферментом, синтезируются как затравки, а затем внутренне дуплицируются и избирательно усиливаются. Более ранние исследования [22] показали, что фермент может узнавать, в частности, последовательности ССС(С) и UUCG. UUCG соответствует последовательности 14|)CG, общей для всех тРНК и специфически взаимодействующей, как известно, с рибосомным фактором элонгации EF Ти, который является субъединицей комплекса (Зр-репли-казы. Сопоставление миди-варианта с последовательностью, состоящей исключительно из двух упомянутых олигонуклеотидов и комплементарных им GGG(G) и CGAA, выявляет совпадение в более чем 75% положений, что говорит об эффективности внутреннего копирования последовательностей-затравок (рис. 57).

Аналогичные соображения можно высказать и о первичных механизмах образования однородных паттернов. Если среди многих паттернов появился 5'GGC/5'GCC и, возможно, также 5'GAC/5'GUC, то эти паттерны в информационной РНК могли породить воспроизводимую трансляцию по механизму Крика и др. [3] и приобрести способность селективно усиливаться с помощью своих воспроизводимых продуктов трансляции.

XVI.7. Какими были первые функционально активные белки?

Простейший белок мог быть гомополипептидом, например полиглицином. Имел ли он какую-нибудь каталитическую активность? На этот вопрос могут и должны дать ответ эксперименты. Гетерогенные последовательности с достаточно большим числом остатков— скажем, 15—30 — способны к образованию р-слоя, имеющего активный центр, в котором концевая карбоксильная группа фиксирована в определенном положении вблизи концевой аминогруппы (рис. 58). Расстояние между ними варьирует с длиной цепи, так как в р-слое антипараллельные цепи закручены [79]. Концевая аминогруппа имеет рК около 8, следовательно, каталитический центр

содержит по меньшей мере эффективную протонную донорно-акцепторную систему. Образованию р-струк-тур благоприятствует чередование остатков Gly—Ala. Однако полипептиды, состоящие исключительно из остатков Gly и Ala, плохо растворимы, поэтому они могут присутствовать в ощутимых количествах лишь на поверхностях раздела.

Строение р-слоев изучали Чоу и Фасман [80], которые проанализировали рентгеноструктурные данные для 29 белков и выявили 459 р-изгибов. В числе трех остатков, чаще всего встречающихся в области Р-изгиба во всех его четырех положениях, находятся Gly и Asp, тогда как в участках, расположенных за р-изгибом, преобладают гидрофобные остатки.

Важной предпосылкой каталитической активности является определенное пространственное расположение концевых групп. Для стабилизации воспроизводимого складывания может оказаться необходимым использование двух или более видов аминокислот. Давно известно, что р-слои являются важными элементами белковой структуры. Согласно Левитту

[81], существует весьма общий принцип стабилизации с их помощью активной конформации белков.

Большая распространенность глицина и аланина

могла в основном определить характер первых белков, но для обеспечения растворимости более длинных

последовательностей были необходимыми полярные

боковые цепи Наличие четырех видов аминокислот привело бы, конечно, к гораздо большей структурной гибкости. Если следующими двумя кандидатами были аспарагиновая кислота и валин, то могли

образоваться глобулярные структуры, стабилизируемые гидрофобными взаимодействиями боковых цепей

валина и аланина и солюбилизируемые карбоксильными боковыми цепями аспарагиновой кислоты. Этот

остаток создает условия для образования специфических каталитических центров с участием двухвалентных ионов металлов.

Нашему воображению слишком трудно охватить колоссальное многообразие всех возможностей. В настоящее время проводятся эксперименты, цель которых состоит в исследовании различных структур в отношении их эффективности в дискриминации различных последовательностей РНК и их структурных особенностей. Результаты, полученные с рибонуклеаза-ми [82], стимулируют поиски «минимальной структур ры», способной специфически узнавать определенные последовательности РНКXVI.8. Необходимы ли при старте синтетазы?

В трехмерной структуре современных тРНК (см. часть А, рис. 14) антикодоновая петля фиксирована на значительном расстоянии от аминоацильного сайта. Такая структура адаптирована к функциональным потребностям современных молекул тРНК, которые определяются рибосомами и структурой синтетаз. С другой стороны, известно, что тРНК может совершать конформационные переходы, которые существенно изменяют ее форму и размеры. Риглер н др. [83] флуоресцентными методами исследовали времена жизни конформационных состояний, va также времена вращательной релаксации и сделали вывод о существовании по меньшей мере трех конформацион-ных состояний, быстро переходящих друг в друга. Аналогичные результаты получены Олсоном и др. [84], которые использовали методы, основанные на рассеянии лазерного излучения. Заселенность различных конформационных состояний сильно зависит от концентрации ионов магния. Важно отметить, что в условиях, которые соответствуют морской воде (~50 мМ Mg2+), присутствует конформер, отличающийся от L-формы, обнаруженной при кристаллографических исследованиях, — по своей форме он гораздо ближе к цилиндру.

Все сказанное самым прямым образом связано с поставленным вопросом. Первичные ферменты состояли из весьма ограниченного числа аминокислотных остатков и поэтому не могли быть, очень большими глобулярными структурами. Для того чтобы гарантировать однозначное соответствие аминокислоты антикодону, либо должны были существовать такие совершенные ферменты, как современные амино-ацйлсинтетазы, либо тРНК должна была иметь такую структуру, чтобы осуществлялся гораздо более тесный контакт между аминоацильным и аникодоновым сайтами, чем в случае L-формы, с тем чтобы можно было одновременно контролировать оба сайта. В противном случае высокий темп мутаций на ранних этапах эволюции очень скоро нарушил бы любое однозначное случайное соответствие между двумя этими сайтами. С другой стороны, конформационный переход все-таки необходим, потому что механизм образования пептидной связи (см. рис. 48) требует достаточного пространственного разделения мРНК и растущей пептидной цепи. Данные, о которых шла речь, вызывают желание поразмыслить о таких возможностях. С другой стороны, при наличии структур типа изображенной на рис. 49, В кодирование первых аминокислот могло бы осуществляться даже без помощи ферментов. Структура самой, тРНК заведомо достаточно сложна, чтобы стало возможным специфическое узнавание. Было отмечено [85], что четвер

тое основание от З'-конца (т. е. основание, следующее за З'АСС) имеет какое-то отношение к антико-дону. Первоначальные предположения об однозначной корреляции для всех тРНК в конечном счете не оправдались. Однако такая корреляция могла играть ключевую роль в первичных механизмах специфического распознавания аминокислот транспортными РНК. По имеющимся данным для Е. coli и фага Т4, в положении, которое следует за З'АСС, находятся такие нуклеотиды: U для Gly, А для Ala, G для Asp и А для Val. Для первичных адапторов было, несомненно, важным обеспечение однозначного соответствия с помощью дискриминирующих сайтов — свойство, которое могло быть частично утеряно в ходе эволюции. Это, конечно, чисто спекулятивные рассуждения, которые требуют экспериментальной проверки.

Вывод. Возможно, синтетазы не были необходимы на самых ранних этапах, а транспортные РНК в конечном счете оказались неудачной попыткой Природы создать ферменты из нуклеиновых кислот. Более эффективное распознавание могло эволюционно развиться из факторов связи, которые были предназначены для специфического узнавания тРНК-подобных структур.

KVI.9. Какими были первые ферменты?

Если синтетазы в действительности не являются необходимыми для зарождения трансляции (а это большое «если»!), то в качестве единственного абсолютного первичного условия согласованной эволюции трансляции у нас остаются только факторы связи — вероятно, репликазы. С помощью такой функции селективное преимущество, заключенное в продукте трансляции, может быть наибол