), присоединенного через С-концевую аминокислоту к инертному носителю (полистиролу или пористому стеклу) в колонке секвенато-

Фенилдаотко цмкзт

H

I i

Фюмтногадштоны

Щелочное

(сочетание)

—R

Водная среда (конверсия)

Н S

н н о н

—N—С—N—С—С—N—I Пептид

" л i —

п

Трнфторувсусная

КЯСЛОТЯ

(отщепленяе)

н

с=о

Аннлююптп явной +

H2N-j Пептид Н И1'0С^™ЬЙ

Укороченный пептид

Рис. 25. Химические реакции, протекающие при секвенировании пептидов и белков (пояснения в тексте)

57

Рис. 26. Принципиальная схема устройства масс-спектрометра:

I—инжекторное устройство для ввода образца; 2— ионизационная камера; 3 в 5—система фильтров; 4—электромагнит; 6—детектор; 7—привод самописца; ?—лента самописца

ра (реакция сочетания). После промывки колонки растворителями (метанол, дихлорэтан) образовавшийся фенилтиокарбамилпептид подвергают воздействию безводной трифторуксусной кислоты, в результате чего высвобождается анилинотиазолинон и в его составе N-концевая аминокислота (реакция отщепления), а укороченный на один аминокислотный остаток пептид или белок остается связанным с носителем. Анилинотиазолинон поступает в коллектор фракций и, далее, после превращения в водной среде в фенилтиогидантоин (реакция конверсии)—на хроматографическое определение отщепившейся N-концевой аминокислоты. Будучи промыт растворителями, секвенатор готов к следующему циклу работы в автоматическом режиме.

Масс-спектрометрический метод определения первичной структуры пептидов, приложимый пока лишь к сравнительно коротким, примерно, 10-членным пептидам, состоит в фрагментации аминокислотного типа эфиров ацилпеп-тидов с последующим разделением полученных при этом положительно заряженных фрагментов. Фрагментацию осуществляют воздействием электронного удара, а разделение фрагментов—в масс-спектрометре (рис. 26). В результате получают масс-спектр фрагментов пептида (рис. 27), расшифровывая который, делают заключение о первичной структуре пептида. Хотя расшиф-

155

U.i.ti...[.. ..ii

ала

ОМе

268

339

L хю

.283 , 1 354 1 т/. 1Г

U_ 1 (Г ililh.lt

",456 481, 512(М+)

200

300

Т 400

Рис. 27. Масс-спектр метилового эфира N-деканоиллейцилаланил-аланилаланина

На рисунке приведены массовые числа, соответствующие аминокислотному типу фрагментации пептида; как ясно из названия исследованного соединение, аминогруппа N-концевой

аминокислоты—лейцина ацилирована и несет деканоильную

группировку, а карбоксильная группа С-концевой аминокислоты—аланина, этерифициро-вана и несет метальную группу; именно такое производное пептида фрагментируется по аминокислотному типу, т. е. преимущественно по пептидным связям с образованием фрагментов, характеризующихся соответствующими массовыми числами

58

ровка масс-спектра фрагментов пептида весьма сложна, однако, исходя из знания аминокислотного состава пептида и используя электронно-вычислительные машины для просчета различных вариантов сочетания аминокислотных остатков в пептиде, находят тот вариант структуры, расчетные данные которого совпадают с экспериментальными.

Заключительный этап работы при выяснении порядка следования аминокислотных остатков в белковой молекуле—воссоздание первичной структуры белка на основании данных о последовательности их расположения в пептидах, полученных при селективном гидролизе. Так как избирательное расщепление пептидных связей при исследовании первичной структуры белков ведут не менее чем двумя агентами, обеспечивающими разрыв пептидных связей в разных точках полипептидной цепи, то первичные структуры того и другого набора полученных пептидов неизбежно перекрываются. Это открывает возможность воссоздания первичной структуры белка (рис. 28). Если при посредстве секвенатора удалось выяснить чередование аминокислотных звеньев в фрагментах белковой молекулы значительного размера, то это существенно упрощает процесс воссоздания ее первичной структуры.

Другие методы определения последовательности расположения аминокислотных остатков в белковой молекуле основаны главным образом на использовании ферментов, способных ускорять реакции последовательного отщепления аминокислот либо с N-, либо с С-конца полипептидной цепи. Однако они не получили еще столь широкого распространения и аппаратурного оформления, как рассмотренные выше. В последние годы ведущее место в выяснении первичной структуры белков занял метод, который условно можно назвать генетическим: он основан на выведении последовательности аминокислот в белковой молекуле исходя из структуры гена, кодирующего биосинтез этого белка. Именно так была расшифрована структура самых длинных полипептидных цепей—фактора VIII свертывания крови (2332 аминокислотных остатка) и субъединицы тиреоглобулина (2750 аминокислотных остатков). Нельзя не упомянуть также только что появившиеся сообщения об определении первичной структуры белков методом лазерной фотодиссоциации; учитывая его высочайшую чувствительность (для анализа достаточно 5 нмоль белка при молекулярной массе 50 к Да), он, по-видимому, имеет большое будущее.

Первым белком, первичную структуру которого удалось расшифровать благодаря работам Ф. Сангера и сотр. (1951 —1953), был инсулин быка (за это в 1958 г. Ф. Сангеру была присуждена Нобелевская премия). Инсулин—белок-гормон, регулирующий углеводный обмен. Он синтезируется в поджелудочной железе в виде предшественника, структура которого показана на рис. 29. При нарушении биосинтеза инсулина у человека развивается сахарное мочеизнурение, или диабет.

Субъединица инсулина (М=6000) состоит из 51 аминокислотного остатка, собранных в две полипептидные цепи (А и Б), которые соединены двумя дисульфидными мостиками.

Согласно справочнику Л. Крофта на август 1975 г. была выяснена первичная структура 932 соединений пептидной природы, из числа которых не менее 800—белки. Учитывая, что в последующее время расшифровывали от нескольких десятков до нескольких сотен первичных структур ежегодно (в 1976 г.—76; в 1977 г.—380), список белков с полностью известным чередованием аминокислот в их молекулах к январю 1985 г. достиг 2657. В ряде случаев определена первичная структура одного и того же белка, но выделенного из разных организмов. Так, первичная структура инсулина, миогло-

59

1°

Глн—вал—лей—тре—асп—вал—глн—вал—ала—лей—вал—лиз— сер— ^_j-i_ т я

20

сер—фен—глу—глу—фен—асн—ала—асн—иле—про—лиз—асн—тре— _Т-2 _я. я Т~3

C-XVI1I-1_

зо

гис—арг—фен—фен—тре—лей—вал—лей—глу—иле—ала—про—

_ „____Tj-4_

и ^ С-9-2 C-XI-5_

40 50 гли—ала—лиз—асп—лей—фен—сер—фен—лей—лиз—гли—сер—

_- _ _Т-5_,__._ '

60

сер—глу—вал—про—глн—асн—асн—про—асп—лей—глн—ала—гис— _ Т-6_

_ С-Х-2_^_

70

ала—гли—лиз—вал—фен—лиз—лей—тре—тир—глу—ала— ала —

_ж 9 Т-7 ж я_Т-8__

„ С-ХХ1-1 л я C-XX1I-4 т щ C-IV-4

ш тл-хххт-б

80

иле—глн—лей—глу—вал—асн—гли—ала—вал—ала—сер—асп—ала—

Т-8_

^ ~_c^i__

90 100

тре—лей—лиз— сер —лей—гли—сер — вал — гис — вал — сер — лиз—

_. _Т-9_

_ж щ С-ХХП-5

но

гли—вал—вал—асп—ала—гис—фен—про—вал—вал—лиз—глу—ала— ^_Т-ю_ ^

C-XVI-5__

120

иле—лей—лиз—тре—иле—лиз—глу—вал—вал—гли—асп—лиз—три— т-и „ _ Т-12 _Т-13_.

C-XXI1-3

130

сер—глу—глу—лей—асн—тре—ала—три—тре—иле—ала—тир— _Т-14_,

C-V11I-4 . • C-V1I-4

140 150

асп—глу—лей—ала—иле—иле—иле—лиз—лиз—глу—мет—лиз—асп—

Т-15 Т-16

_^_ _^_Тл-ХХХ-1_, л Тл—XXVI—2

, CNBr

153

ала—ала

Т-17 Рис. 28. Воссоздание первичной группы леггемоглобина по

данным о первичной структуре пептидов, полученных при его селективном гидролизе трипсином (Т), химотрипсином (С) и термолизином (Тл)—микробной протеиназой, специфичной к остаткам гидрофобных аминокислот, а также при его расщеплении бромциа-

ном CNBr

Леггемоглобин—кислородсвязывающий гемопротенн бобовых растений, играющий важную роль в фиксации молекулярного азота клубеньковыми бактериями. Т—1, Т—2 и т. д.—триптические пептиды; С—1, С—IV и т. д.—химотриптические; Тл—XXX, Тл—XXXI и т. д.—термолизиновые; CNBr—цианобромидные пептиды. Перекрывающиеся зоны стрелок отмечают перекрытия пептидов из разных гидролизатов, а на стыках стрелок расположены точки селективного распада полипептидной цепи. Первичная структура фрагментов, содержащих аминокислотные остатки с 1-го по 24-й и с 29-го по 58-й, определена с помощью секвенатора

о

Дисульфидиые мостики

Рис. 29. Первичная структура проинсулина быка

Олептид отщепляется от проинсулина в процессе превращения его в инсулин под воздействием специфического фермента, ускоряющего гидролиз пептидных связей по остаткам яргинина

в позициях 31 и 60

бина и гемоглобина изучена у 20 видов, цитохрома с—у 60, лизоцима—у 10 и т. д. Ниже приведены первичные структуры перечисленных белков, характерные для человека:

61

Инсулин из поджелудочной железы человека, цепь А (21 амююкислотный остаток): Гли - иле - вал - глу - глн - цис - цис - тре - сер - иле - цис - сер - лей - тир-глн-лей -глу - асн - тир - цис - асн; цепь В (30 аминокислотных остатков) -

Фен - вал - асн - глн - гис - лей - цис - гли - сер - гис - лей - вал - глу-ала - лей - тир -лей - вал - цис - гли - глу - арг - гли - фен - фен - тир - тре - про - лиз - тре.

Цитохром с из сердца человека (104 аминокислотных остатка): СН3СО - гли - асп - вал - глу - лиз - гли - лиз - лиз - иле - фек - иле - мет - лиз - цис -(сер - глн) - цис - гис - тре - вал - глу - лиз - гли - гли - лиз - гис - лиз - тре - гли - про -асн - лей - гис - гли - лей - фен - гли - арг - лиз - тре - гли - глн - ала - про - гли - тир -сер - тир - тре - ала - ала - асн - лиз - асн - лиз - гли - иле - иле - три - гли - глу - асп -тре - лей - мет - глу - тир - лей - глу - асн - про - лиз - лиз - тир - иле - про - гли - тре лиз - мет - иле - фен - вал - гли - иле - лиз - лиз - лиз - глу - глу - арг - ала - асп - лей -иле - ала - тир - лей - лиз - лиз - ала - тре - асн - глу.

Миоглобин человека (153 аминокислотньгх остатка):

Гли - лей - сер - асп - гли - глу - три - глн - лей - вал - лей - асн - вал - три - гли - лиз -вал - глу - ала - асп - иле - про - гли - гис - гли - глн - глу - вал - лей - иле - арг - лей -фен - лиз - гли - гис - про - глу - тре - лей - глу - лиз - фен - асп - лиз - фен - лиз - гис -лей - лиз - сер - глу - асп - глу - мет - лиз - ала - сер - глу - асп - лей - лиз - лиз - гис -гли - ала - тре - вал - лей - тре - ала - лей - гли - гли - иле - лей - лиз - лиз - лиз - гли -гис - гис - глу - ала - глу - иле - лиз - про - лей - ада - глн - сер - гис - ала - тре-лиз -гис - лиз - вал - про - иле - лиз - тир - лей - глу - фен - иле - сер - глу - цис - иле - иле -гли - вал - лей - гли - сер - лиз - гас - про - гли - асп - фен - гли - ала - асп - ала - глн -гли - ала - мет - асн - лиз - ала - лей - глу - лей - фен - apt - лиз - асп - мет - ала - сер -асн - тир - лиз - глу - лей - гли - фен - глн - гли.

а - Цепь гемоглобина человека (141 аминоклшотный остаток):

Вал - лей - сер - про - ала - асп - лиз - тре - асн - вал - лиз - ала - ала - три - гли - лиз -вал - гли - ала - гис - ала - гли - глу - тир - гли - ала - глу - ала - лей - глу - арг - мет -фен - лей - сер - фен - про - тре - тре - лиз - тре - тир - фен - про - гис - фен - асп - лей сер - гис - гли - сер - ала - глн - вал - лиз - гли - гис - гли - лиз - лиз - вал - ала - асп -ала - лей - тре - асн - ала - вал ~ ала - гис - вал - асп - асп - мет - про - асн - ала - лей -сер - ала - лей - сер - асп - лей - гис - ала - гис - лиз - лей - арг - вал - асп - про - вал -асн - фен - лиз - лей - лей - сер - гис - цис - лей - лей - вал-тре - лей - ала - ала - гис -лей - про - ала - глу - фен - тре - про - ала - вал - гис - ала - сер - лей - асп - лиз - фен -лей - ала - сер - вал - сер - тре - вал - лей - тре - сер - лиз - тир - арг.

(3 - Цепь гемоглобина человека (146 аминокислотных остатков): Вал - гис - лей - тре - про - глу - глу - лиз - сер - ала - вал - тре - ала - лей - три - гли -лиз - вал - асп - вал - асп - глу - вал - гли - гли - глу - ала - лей - гш - apt - лей - лей -вал - вал - тир - про - три - тре - глн - арг - фен - фен - глу - сер - фен - гли - асп - лей ¦ сер - тре - про - асп - ала - вал - мет - гли - асн - про - лиз - вал - лиз - ала - гис - гли -лиз - лиз - вал - лей - гли - ала - фен - сер - асп - гли - лей - ала - гис - лей - асн - асн -лей - лиз - гли - тре - фен - ала - тре - лей - сер - глу - лей - гис - цис - асп - лиз - лей -гис - вал - асп - про - глу - асн - фен - арг - лей - лей - гли - асн - вал - лей - вал - цис -вал - лей - ала - гис - гис - фен - гли - лиз - глу - фен - тре - про - про - вал - глн - ала -ала-т1ф-глн-лиз-воя-вал-ам-гш-вал-от-а/т.-от-лей-am- гис-л тир - гис.

Лизоцим молока человека (130 ашшокяслотных остатков):

Лиз - вал - фен - глу - apt - цис - глу - лей - ала - арг - тре - лей - лиз - арг - лей - гли -мет - асп - гли - тир - арг - гли - иле - сер - лей - ала - асн - три - мет - цис - лей - ала лиз - три - глу - сер - гли - тир - асн - тре - apt - ала - тре - асн - тир - асн - ала - гли ¦ асп - арг - сер - тре - асп - тир - гли - иле - фен - гли - иле - асн - сер - арг - тир - три -цис - асн - асп - гли - лиз - тре - про - гли - ала - вал - асн - ала - цис - гис - лей - сер -цис - сер - ала - лей - лей - глн - асп - асн - иле - ала - асп - ала - вал - ала - цис - ала -лиз - арг - вал - вал - арг - асп - про - глн - гли - иле - арг - ала - три - вал - ала - три -арг - асн - apt - цис - глн - асн - арг - асп - вал - арг - глн - тир - вал - глн - гли - цис -

В Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина выполнен анализ первичной структуры Р- и Р'-субъединиц ДНК-зависимой РНК-полимера-зы—белков, имеющих очень длинные полипептидные цепи, 1342 и 1407 аминокислотных остатков соответственно; аспартатамино-трансферазы из сердца свиньи—412; леггемоглобина из клубеньков желтого люпина—153; LIV (лей, иле, вал)—связывающего белка из кишечной палочки—344; нейро-токсинов из яда среднеазиатской кобры—72; белков L10 и L25 из рибосом кишечной палочки—164 и 94 соответственно; а-субъединицы ДНК-зависимой РНК-полимеразы—329; инсектотоксина из яда среднеазиатского скорпиона— 62; зрительного родопсина—348; фактора элонгации G—701; 7-субъединицы ГТФ-связывающего белка и 7-субъединицы цикло-ГМФ-фосфодиэстеразы из сетчатки крупного рогатого скота—69 и 87 соответственно; С39-белка из мозжечка быка—341; а- и Р-субъединиц Na+, К+-АТФазы из почек свиньи— 1016 и 302 аминокислотных остатков соответственно.

В нашей же стране расшифрованы первичные структуры пепсина свиньи— 313 остатков (В. М. Степанов и др.); стурина—27 (А. Б. Силаев); актиноксан-тина—-107 (П. Решетов); лактогенного гормона —198 (Н. А. Юдаев); полиэд-ренного белка вируса ядерного полиэдроза—244 (С. Б. Серебряный и др.); нейротоксина из яда среднеазиатского скорпиона—65 (Е. Гришин и др.); холестерин—гидроксилирующего цитохрома Р-450 из митохондрий коры надпочечников быка—481 (В. А. Чащин и др.); а- и Р-субъединиц лютеинизиру-ющего гормона из гипофиза кита—96 и 118 соответственно (В. С. Карасев и др.); кальмодулина из мозга че