составлены из субъединиц двух типов, обозначаемых условно как субъедшшцы типа А и В. Они сходны друг с другом, но отличаются по некоторым деталям первичной и третичной структур. В зависимости от соотношения протомеров типа АиВв мультимере последний может существовать в виде нескольких изомеров, которые называют изозимами. Так, при четырех субъединицах возможны 5 изозимов:

/ // /// IV V

АААА АААВ ААВВ АВВВ ВВВВ

Это явление хорошо изучено у фермента, ускоряющего в мышцах превращение молочной кислоты в пировиноградную и обратно:

сн3—сн—соон °гаслего'е > сн3—с—соон

Восстановление q

Молочная кислота Пировиноградная

кислота

100

Так как окисление молочной кислоты (acidum lacticwri) сопровождается отнятием атомов Н, этот фермент называют лактатдегидрогеназой. Молекула лактатдегидрогеназы (М = 140 ООО) составлена из четырех субъединиц (М = 35000), которые условно обозначают Н и М (от англ. heart—сердце и muscle—мышцы), так как из сердца и скелетных мышц выделены / и V типы лактатдегидрогеназы. Следовательно, изозимы лактатдегидрогеназы таковы:

/ // /// IV, V

нннн нннм ннмм нммм мммм

Они отличаются друг от друга по степени активности, некоторым физическим свойствам (например, молекулярной массе, электрофоретиче-ской подвижности), локализации в органах и тканях и т. п. В зависимости от возраста, физиологического состояния и других причин в организме устанавливается то или иное соотношение изозимов, которому соответствует определенный уровень активности фермента в целом. Изменение соотношения изозимов во всем организме или в отдельных тканях и органах представляет, таким образом, один из способов регуляции действия ферментов.

В настоящее время интерес к изозимам резко повысился. Оказалось, что кроме генетически детерминированных изозимов существует большая группа ферментов, обладающая множественными формами, возникающими в результате их посттрансляционной модификации (см. гл. VII). Множественные формы ферментов и изозимы в частности используются сейчас для диагностики болезней в медицине, прогнозирования продуктивности животных, подбора родительских пар при скрещивании для обеспечения максимального гетерозиса в потомстве и т. п.

Значение пространственной организации ферментов особенно ярко выявляется при изучении строения так называемых мультиэнзимов, т. е. ферментов, обладающих способностью ускорять одновременно несколько химических реакций и осуществлять сложные превращения субстрата. Примером может служить мультиэнзим, ускоряющий реакцию окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты (см. гл. VIII). Этот многоферментный комплекс с М=4 500000 состоит из трех видов ферментов. Первый из них (Ei) ускоряет реакцию декарбоксилирования пировиноградной кислоты. В состав комплекса входит 12 димерных молекул этого фермента (М= 192000), изображенных на рис. 46, Г в виде крупных белых шаров, расположенных попарно по периметру рисунка. Второй и третий ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные процессы при окислении пировиноградной кислоты, сосредоточены внутри мультиэнзимного комплекса. Один из них (Е3) представлен шестью димерными молекулами (М = 112 000), другой (Е2)—24 протомерами (Af=70000) (см. рис. 46, заштрихованные крупные и мелкие шары соответственно).

В тех случаях, когда мультиэнзимный комплекс обслуживает единый, многоступенчатый процесс биохимических превращений, его называют мета-болоном (от слова метаболизм—обмен веществ). Таковы метаболоны гликолиза (см. гл. VIII), биосинтеза ряда аминокислот (см. гл. VII), цикла дикарбо-новых и трикарбоновых кислот (см. гл. VIII) и др.

В результате слаженного во времени и пространстве действия всех трех видов входящих в его состав ферментов мультиэнзим с огромной скоростью осуществляет превращение пировиноградной кислоты. Именно

101

в кооперативном характере каталитического процесса и кроется главное отличие биокатализаторов от катализаторов неорганической природы, именно поэтому интенсивность биокатализа в десятки, сотни и тысячи раз превосходит мощность действия неорганических катализаторов.

Сравнительно недавно выявлена еще одна своеобразная черта в строении ферментов: некоторые из них являются полифункциональными, т. е. обладают несколькими энзиматическими активностями, но всего лишь одной полипептидной цепью. Дело в том, что эта единая цепь при формировании третичной структуры образует несколько функционально и стерически обособленных глобулярных участков—доменов, каждый из которых характеризуется своей каталитической активностью. В последующих главах будут приведены соответствующие примеры.

При изучении мультиэнзимных комплексов и полифункциональных ферментов удалось понять наиболее важную особенность ферментативного катализа, а именно—эстафетную передачу промежуточных продуктов реакции от одного компонента каталитической системы к другому без их высвобождения.

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

Механизм действия однокомпонентных и двухкомпонентных ферментов однотипен, так как активные центры в их молекулах функционально сходны между собой.

Ведущую роль в механизме ферментативного катализа играет образование фермент-субстратных комплексов, на существование которых впервые указал Д. Браун (1902). На первой фазе ферментативного катализа между субстратом (или субстратами) и ферментом возникает соединение, в котором реагенты связаны друг с другом ионной, ковалентной или иного типа связью. Затем (вторая фаза) субстрат под действием присоединенного к нему фермента претерпевает изменение, делающее его более доступным для соответствующей химической реакции. На третьей фазе происходит сама химическая реакция и, наконец, образовавшиеся продукты реакции на четвертой фазе освобождаются из фермент-продуктного комплекса. Если обозначить фермент Е, субстрат 5, активированный субстрат S' и продукт реакции Р, то указанная последовательность процессов выразится нижеследующей схемой:

/ // /// IV

Е+ S**ES**ES '&ЕР&Е+Р.

Эта схема была первоначально разработана В. Генри (1903), затем Л. Михаэлисом и М. Ментен (1913) и подтверждена прямым выделением ES-, ES' и .ЕР-комплексов.

Одним из примеров ферментативного катализа, осуществляемого в соответствии с приведенной схемой, может служить реакция гидролиза ацетилхолина. Это соединение служит медиатором (посредником) при передаче нервных импульсов: в ответ на выделение окончанием нервного волокна ацетилхолина следует ответная реакция возбуждения нервной клетки. Чтобы этот процесс протекал непрерывно, после каждого акта передачи нервного импульса вызвавшая возбуждение порция ацетилхолина (1—2 мкг) должна быть полностью разрушена. Это достигается посредством реакции гидролиза ацетилхолина при участии фермента ацетилхолинэстеразы. 1ид-

102

г в

Рис. 47. Механизм действия ацетилхолинэстеразы: •

А—активный центр фермента; Б—фермент-субстратный комплекс, В—подготовка к преобразованию (активирование) субстрата; /'—комплекс продуктов реакции с ферментом (пояснения в тексте)

ролиз осуществляется с огромной скоростью: 1—2 мкг ацетилхолина за 0,1—0,2 мс:

СН3 - СО - О - СН2 - СН2 - N(CH3)3+н2о

Адетнлхо/пш

-. СН3 - СООН+НО - СН2 - СН2 - N(CH3)3

Уксусная Ходив

Ацетилхолинзстераза—однокомпонентный фермент. В ее активном центре сосредоточены по меньшей мере 4 аминокислотных радикала—глу, сер, гис и тир, обеспечивающие последовательное осуществление перечисленных выше этапов ферментативного катализа.

Сначала между ферментом (ацетилхолинзстераза) и субстратом (аце-тилхолин) возникает фермент-субстратный комплекс. Он образуется за счет электростатического взаимодействия между отрицательно заряженной

103

ионизированной СООН-гругшой радикала глу и положительно заряженным атомом N молекулы ацетилхолина (рис. 47, /, Б). После образования фег> мент-субстратного комплекса вступают в действие остальные аминокислотные радикалы активного центра ацетилхолинэстеразы. В первую очередь замыкается связь между углеродом поляризованной СО-группы ацетильного радикала холина и кислородом ОН-группы остатка сер. Затем возникает водородная связь между кислородом сложноэфирной связи в молекуле ацетилхолина и ОН-группой радикала тир (рис. 47, //, В).

Расположение молекулы ацетилхолина и радикалов сер и тир в активном центре фермента таково, что образование упомянутых связей ослабляет связь между СО-группой и атомом кислорода сложноэфирной связи в молекуле ацетилхолина (эффект «дыбы»). В результате для ее разрыва требуется гораздо меньше энергии, т. е. энергетический барьер оказывается сниженным вследствие активации молекулы ацетилхолина (^'-комплекс). Поэтому под влиянием радикала гис, оттягивающего на себя протон от ОН-группы сер, упрочняется сложноэфирная связь между радикалом сер и ацетильной группой с одновременным разрывом сложноэфирной связи в молекуле ацетилхолина и переходом протона от радикала тир к остатку холина (рис. 47, ///, Г). Последний высвобождается из активного центра (рис. 47, IV), а его место занимает молекула воды. Она ббразует связь с карбонильным кислородом ацетильной группы и кислородом тир (на рис. 47 этот этап не показан), после чего протон от остатка гис возвращается к кислороду ОН-группы сер, а протон воды—к радикалу тир. Одновременно выделяется второй продукт реакции—уксусная кислота и регенерируется свободный активный центр ацетилхолинэстеразы (рис. 47, IV, А ), готовый к новому акту катализа.

В процессе образования фермент-субстратного комплекса и на дальнейших фазах ферментативного катализа происходят неоднократные изменения третичной структуры фермента, приводящие к последовательному сближению с субстратом и ориентации в пространстве тех активных групп, которые взаимодействуют друг с другом на различных этапах преобразования субстрата. Изменение третичной структуры белка невозможно без участия всей или почти всей полипептидной цепи, образующей белковую молекулу. Следовательно, в каталитическом акте принимает участие по существу вся или почти вся молекула фермента.

Отдельные этапы взаимодействия фермента и субстрата при ферментативном катализе все более проясняются. В частности, установлено, что за стадией адсорбции субстрата в активном центре фермента наступает «узнавание» субстратным центром фермента той части молекулы субстрата, которая непосредственно не подвергается химическому преобразованию. За счет возникающих при этом многоточечных контактов, реализующихся в виде сил слабого взаимодействия (гидрофобные, водородные и др.), связь субстрата с ферментом упрочняется. Одновременно с этим в активном центре фермента «стабилизируется» та часть субстрата, которая в дальнейшем участвует в химической реакции,—она фиксируется в напряженной конфигурации, близкой к переходному состоянию субстрата при превращении его в продукт. В результате реагируюпшй фрагмент молекулы субстрата и каталитические группы фермента образуют продуктивный комплекс, где уже частично осуществлены электронно-конформационные переходы, необходимые для протекания собственно химической стадии ферментативного процесса. Это приводит к понижению энергии активации, необходимой для осуществления химической реакции, благодаря энтропийному эффекту вследствие иммобилизации, закрепления, жесткой ориентации субстрата в актив-

104

ном центре фермента. Таким образом, каждое звено в многостадийной химической реакции, ускоряемой ферментом, создает почти оптимальные условия для прохождения ее следующего этапа. Как следствие, химическая реакция при ферментативном катализе идет в десятки, сотни тысяч раз быстрее.

Рассмотрение тонкого механизма ферментативного катализа позволяет понять специфику действия ферментов, отличающую их от катализаторов неорганического происхождения. Уникальная структура и взаимодействие каталитического, субстратного и аллостерического центров фермента обеспечивает кооперативное осуществление многостадийных процессов. Именно упорядоченность реакций в пространстве и времени, их кооперативный характер отличают действие биокатализаторов, обеспечивая высокую специфичность и скорость процесса в целом.

КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

Под ферментативной кинетикой в широком смысле понимают зависимость скорости реакции, ускоряемой ферментом, от химической природы реагирующих- веществ (субстраты, фермент) и условий их взаимодействия (концентрация, температура, рН среды, наличие активаторов или ингибиторов и т. п.). Однако зависимость скорости ферментативного процесса от температуры, рН среды и влияния ингибиторов и активаторов в значительной мере связана с изменением свойств фермента как белкового тела. Поэтому здесь будет освещен только вопрос о закономерностях, определяемых природой и концентрацией реагирующих веществ и их изменением.

Как показано выше, первой фазой биокаталитического процесса является образование фермент-субстратного комплекса:

E+Se=* ES. l-i

Эта равновесная система может быть охарактеризована соответствующей константой равновесия. Величину, обратную ей, называют константой диссоциации фермент-субстратного комплекса или субстратной константой и обозначают Ks:

Ks=[E][S-\/[ES-\.

Она зависит от природы субстрата и фермента и отражает степень их сродства. Так, для сахаразы (фермент, ускоряющий реакцию гидролиза сахарозы) Aj=0,0167M, т. е. концентрация фермент-субстратного комплекса превышает концентрацию свободных фермента и субстрата примерно в 60 раз. Чем ниже значение К„ тем выше, следовательно, сродство фермента к субстрату.

Так как концентрация фермент-субстратного комплекса изменяется вследствие перехода последнего в продукт реакции с регенерацией свободного фермента:

ES-*Е+Р,

то значение Ks находят из соотношения констант скоростей прямой (к+1) и обратной (k-j) реакций, т. е.

Ks=k-i/ k+i.

105

К указанному выводу можно прийти, приравнивая скорости прямой и обратной реакций, что характерно для равновесного состояния системы: Vi=k+jE\[S~\; и2=А;_1[?5]. Если Vi = v2, то тогда к+1 \Е\ [5]=*;-! [ES\ т- е. ЙИ7[Е5]=Л_1 Д+1-А^

Таким образом, субстратная константа, или константа диссоциации, фермент-субстратного комплекса (rQ характеризует биокаталитический процесс с точки зрения сродства фермента и субстрата и соотношения констант скорости реакций распада и становления фермент-субстратного комплекса.

Так как одновременно с диссоциацией фермент-субстратного комплекса на исходные вещества происходят превращения субстрата в продукт и распад комплекса фермент—продукт на составляющие его компоненты:

»+1 »+2

E+S?±ES—i

Е+Р

для полной характеристики ферментативного процесса введено понятие о константе Михаэлиса (Кт), которая представляет отношение констант скоростей всех трех реакций, осуществляющихся в процессе ферментативного катализа: K„=(k-i+k+2)Ik+t. Кт всегда несколько выше по числовому значению, чем К,. Так, Ks для комплекса сахаразы и сахарозы равно 0,0167М, а Кт составляет 0.0280М.

Скорость химической реакции, ускоряемой ферментом (как и скорость обычной химической реакции), измеряют количеством молей субстрата, превращаемых в единицу времени. Однако принципиально важно, чтобы при этом под