держивались стандартные условия для проявления активности фермента: температура 25° С, оптимальное значение рН и, что особенно существенно, полное насыщение фермента субстратом. Скорость ферментативной реакции, измеренной при соблюдении перечисленных условий, обозначают V и называют максимальной скоростью ферментативной реакции. Она определяется концентрацией фермента и константой скорости распада комплекса фермент-продукт: V=k+2\f]-

Скорость ферментативной реакции, наблюдаемую при отсутствии полного насыщения фермента субстратом, обозначают v. Она в каждый данный момент пропорциональна концентрации фермент-субстратного комплекса: v=k+2[ES~\. Так как [?S] = =*Л+1[5], a k+1lk-l = l/K„ т. е.

= то v=k+1[E][s)lKs.

Таким образом, наблюдаемая скорость ферментативной реакции зависит от концентрации фермента и субстрата и их сродства. Численно Кт равна той концентрации субстрата (в молях на литр), при которой v составляет 1/2К(рис. 48). о,1 о,2 аз ofi Концентрацию фермента и субстрата

Концентрация субстрата [Sh толь выражают обычно в микромолях на литр.

Однако ввиду того, что точная молекулярная масса большинства ферментов и число каталитических (активных) центров в их молекулах неизвестны, применяют условный способ выражения абсолютного количества фермента. За единицу лю-

Рис. 48. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при постоянной концентрации фермента

По достижении состояния насыщения фермента субстратом скорость ферментативной реакции достигает максимального значения V и кривая идет параллельно оса абсцисс

106

бого фермента (обозначаемую на русск. и нем. Е, а на англ., франц., итал. и исп. U) принимают то его количество, которое в стандартных условиях катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в 1 мин. Эта величина (1 мкмоль/мин) является также единицей активности фермента. Указанная стандартная система обозначения количества фермента была введена в 1961 г. Комиссией по ферментам Международного биохимического союза и прочно вошла в ферментологию. Ею пользуются и поныне. Как отмечено выше, согласно этой системе скорость ферментативной реакции выражали числом микромолей субстрата, превращаемых в 1 мин.

В 1972 г., в связи с переходом на выражение скорости биокаталитических превращений в молях субстрата, преобразуемого в течение 1 с, было предложено вместо старой, безымянной единицы ферментативной активности (Е или U) ввести новую единицу—катал (символ—кат), обозначающую количество фермента, способное в течение 1 с обеспечить превращение 1 моля субстрата (в стандартных условиях). Так как единица ферментативной активности в 1 кат, соответствующая скорости реакции 1 моль/с, мало реальна (превращения идут с гораздо меньшей скоростью), каталитическую активность в новой системе единиц выражают в микрокаталах (мккат), нанокаталах (нкат) и пикокаталах (пкат), чему отвечают скорости реакций в микромолях, нано-молях и пикомолях в секунду соответственно. Старая единица (Е или U) равна 16,67 нкат. В течение ближайших лет предполагают осуществить переход на выражение ферментативной активности в каталах.

Концентрацию фермента в растворе в указанных единицах (Е) выражают числом их в 1 мл раствора. В случае сухого препарата фермента приводят данные о количестве Е на 1 мг. Если в препарате фермента определено содержание белка, то высчитывают удельную активность ферментного препарата, выражаемую числом Е на 1 мг белка. При наличии данных о числе Е в 1 мг чистого фермента говорят об удельной активности фермента. Если известна молекулярная масса фермента, то легко рассчитать число Е на 1 мкмоль его, т. е. молекулярную активность фермента. Следовательно, речь идет уже не о выражении концентрации фермента, а о выражении активности фермента либо числом микромолей субстрата, превращенных в 1 мин 1 мг фермента (удельная активность фермента), либо числом молекул субстрата, превращенных в 1 мин одной молекулой фермента (молекулярная активность).

Если известно, сколько активных центров находится в молекуле фермента, активность его характеризуют числом молекул субстрата, превращенных при посредстве одного активного центра. Так, молекулярная активность каталазы равна 5 млн., тогда как активность ее каталитического центра (их в молекуле каталазы 4) составляет всего 1 млн. 250 тыс. молекул Н202.

СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ

Будучи белками, ферменты обладают всеми их свойствами. Вместе с тем биокатализаторы характеризуются рядом специфических качеств, тоже вытекающих из их белковой природы. Эти качества отличают ферменты от катализаторов обычного типа. Сюда относятся термолабильность ферментов, зависимость их действия от значения рН среды, специфичность и, наконец, подверженность влиянию активаторов и ингибиторов.

Термолабильность ферментов объясняется тем, что температура, с одной стороны, воздействует на белковую часть фермента, приводя при слишком высоких значениях к денатурации белка и снижению каталитической функции,

107

у,мкмоль/мин

0,10

Рис. 49. Влияние температуры на Рис. 50. Влияние рН среды на ак-

активность фермента (пояснение тивность фермента

в тексте)

а с другой стороны, оказывает влияние на скорость реакции образования фермент-субстратного комплекса и на все последующие этапы преобразования субстрата, что ведет к усилению катализа.

Зависимость каталитической активности фермента от температуры выражается типичной кривой (рис. 49). По характеру кривой видно, что до некоторого значения температуры (в среднем до 50° С) каталитическая активность растет, причем на каждые 10° С примерно в 2 раза повышается скорость преобразования субстрата. В то же время постепенно возрастает количество инактивированного фермента за счет денатурации его белковой части. При температуре выше 50° С денатурация ферментного белка резко усиливается и, хотя скорость реакций преобразования субстрата продолжает расти, активность фермента, выражающаяся количеством превращенного субстрата, падает.

Детальные исследования роста активности ферментов с повышением температуры, проведенные в последнее время, показали более сложный характер этой зависимости, чем указано выше: во многих случаях она не отвечает правилу удвоения активности на каждые 10° С в основном из-за постепенно нарастающих конформационных изменений в молекуле фермента.

Температура, при которой каталитическая активность фермента максимальна, называется его температурным оптимумом.

Температурный оптимум для различных ферментов неодинаков. В общем для ферментов животного происхождения он лежит между 40 и 50° С, а растительного—между 50 и 60° С. Однако есть ферменты с более высоким температурным оптимумом, например у папаина (фермент растительного происхождения, ускоряющий гидролиз белка) оптимум находится при 80° С. В то же время у каталазы (фермент, ускоряющий распад Н202 до Н20 и 02) оптимальная температура действия находится между 0 и 10° С, а при более высоких температурах происходит энергичное окисление фермента и его инактивация.

Зависимость активности фермента от значения рН среды была установлена свыше 50 лет назад. Для каждого фермента существует оптимальное значение рН среды, при котором он проявляет максимальную активность. Большинство ферментов имеет максимальную активность в зоне рН поблизости от нейтральной точки. В резко кислой или резко щелочной среде хорошо работают лишь некоторые ферменты (табл. 10).

108

Таблица 10

Оптимальные значения рН среды для некоторых ферментов

Характер катализируемой реакции

Пепсин

Липаза (из семян клещевины)

Уреаза Трипсин

Аргиназа

Гидролиз белка Гидролиз жиров » мочевины » белка » аргинина

1,5—2,5 4,7-5,0 7,0

7,8

9,5-9,9

Переход к большей или меньшей (по сравнению с оптимальной) концентрации водородных ионов сопровождается более или менее равномерным падением активности фермента. На рис. 50 представлена кривая, выражающая типичную зависимость каталитического действия фермента от рН среды.

Влияние концентрации водородных ионов на каталитическую активность ферментов состоит в воздействии ее на активный центр. При разных значениях рН в реакционной среде активный центр может быть слабее или сильнее ионизирован, больше или меньше экранирован соседними с ним фрагментами полипептидной цепи белковой части фермента и т. п. Кроме того, рН среды влияет на степень ионизации субстрата, фермент-субстратного комплекса и продуктов реакции, оказывает большое влияние на состояние фермента, определяя соотношение в нем катионных и анионных центров, что сказывается на третичной структуре белковой молекулы. Последнее обстоятельство заслуживает особого внимания, так как определенная третичная структура белка-фермента необходима длЯ образования фермент-субстратного комплекса.

Специфичность—одно из наиболее выдающихся качеств ферментов. Это свойство их было открыто еще в прошлом столетии, когда было сделано наблюдение, что очень близкие по структуре вещества—пространственные изомеры (а- и Р-метилглюкозиды) расщепляются по эфирной связи двумя совершенно разными ферментами:

Таким образом, ферменты могут различать химические соединения, отличающиеся друг от друга очень незначительными деталями строения, такими, например, как пространственное расположение метоксильного радикала и атома водорода при 1-м углеродном атоме молекулы метилглюкозида.

По образному выражению, нередко употребляемому в биохимической литературе, фермент подходит к субстрату, как ключ к замку. Это знаменитое правило было сформулировано Э. Фишером в 1894 г. исходя из того, что специфичность действия фермента предопределяется строгим соответствием геометрической структуры субстрата и активного центра фермента.

В 50-е годы нашего столетия это статическое представление было заменено гипотезой Д. Кошланда об индуцированном соответствии субстрата и фермента.

а-Метилглюкозид (гидролизуется по эфирной связи ферментом из солода)

В -Мети лгл ю козид (гидролизуется по эфирной связи ферментом из семян

горького миндаля)

109

Сущность ее сводится к тому, что пространственное соответствие структуры субстрата и активного центра фермента создается в момент их взаимодействия друг с другом, что может быть выражено формулой «перчатка—рука». При этом в субстрате уже деформируются некоторые валентные связи и он, таким образом, подготавливается к дальнейшему каталитическому видоизменению, а в молекуле фермента происходят конформационные перестройки. Гипотеза Кошланда, основанная на допущении гибкости активного центра фермента, удовлетворительно объясняла активирование и интибирование действия ферментов и регуляцию их активности при воздействии различных факторов. В частности, конформационные перестройки в ферменте в процессе изменения его активности Д. Кошланд сравнивал с колебаниями паутины, когда в нее попала добыча (субстрат), подчеркивая этим крайнюю лабильность структуры фермента в процессе каталитического акта.

В настоящее время гипотеза Кошланда постепенно вытесняется гипотезой топохимического соответствия. Сохраняя основные положения гипотезы взаимо-индуцированной настройки субстрата и фермента, она фиксирует внимание на том, что специфичность действия ферментов объясняется в первую очередь узнаванием той части субстрата, которая не изменяется при катализе. Между этой частью субстрата и субстратным центром фермента возникают многочисленные точечные гидрофобные взаимодействия и водородные связи.

Несомненно, что специфичность ферментов объясняется в первую очередь совпадением пространственных конфигураций субстрата и субстратного центра фермента. Видимо, только тогда, когда совпадение это достаточно полно, может образоваться фермент-субстратный комплекс и, следовательно, начаться процесс ферментативного катализа. Выяснение третичной структуры некоторых белков-ферментов полностью оправдало такую точку зрения. Так, в молекуле лизоцима (фермент, ускоряющий гидролиз гликозидных связей в полисахаридах клеточной стенки бактерий) обнаружена выемка (щель) (см. рис. 34) для присоединения субстрата. В эту выемку плотно входит участок молекулы субстрата протяженностью ровно в шесть звеньев:

соон соон соон

Остаток Остаток N-ацетил- N-ацетил-глюкоымина мураминовой кислоты

Остальная часть молекулы субстрата, состоящая из нескольких сотен остатков аминосахаров или их производных, остается свободной. Не только общая форма щели в молекуле лизоцима соответствует параметрам входящего в нее участка субстрата, но и расположение отдельных аминокислотных радикалов в субстратном центре этого фермента совершенно точно согласуется с размещением определенных атомов и атомных групп в молекуле субстрата. Именно за счет указанных радикалов и групп замыкаются водородные связи между лизоцимом и полисахаридом в процессе становления фермент-субстратного комплекса (табл. 11).

ПО

Таблица 11

Многоточечное взаимодействие фрагмента молекулы полисахарида клеточной стенки бактерии с лизоцимом

Буквенные обозначения полисахарндлых звеньев Число связей и слабых взаимодействий Энергия ассоциации, кДж/моль

водородных Ван-дер-Ваальса А . 1 7 7,5—9,6

В 1 11 11,7—16,3

С 4 30 19,6—23,8

D 2 35 12,1—25,0

Е 3 45 3,8—16,7

F 4 13 6,3—21,0

Одновременно против радикалов каталитического центра (остатки глу и асп, занимающие в полипептидной цепи лизоцима 35-е и 52-е положения соответственно) устанавливается гликозидная связь, расположенная между кольцами D и Е субстрата, и наступает каталитический акт:

:н2он

NH—со—снэ н

Глуи

ноос

I

/

H NH—СО—СНЭ Н

Глу35

Н2ОН

'OOC

н,с—со

Приведенная схема еще раз иллюстрирует механизм ферментативного катализа.

Детальное изучение специфичности ферментов показало, что Пределы ее у разных ферментов различны. Одни ферменты обладают абсолютной специфичностью, т. е. каталитически ускоряют одну-единственную реакцию. Примером такого фермента может служить уреаза. Другие ферменты осуществляют катализ реакций определенного типа независимо от того, какие конкретные вещества в них взаимодействуют или распадаются. Основным признаком для ферментов этого типа является характер разрушаемой или создаваемой связи. Такие ферменты характеризуются, следовательно, групповой специфичностью. Некоторые ферменты отличаются стереохимической специфичностью, т. е. действуют только на один из пространственных изомеров Примером могут служи >ь уже упоминавшиеся выше ферменты, расщепляющие а- и Р-метилг-люкозиды.

Влияние на ферменты активаторов и ингибиторов впервые было обнаружено при изучении активаторов (стимулин) и ингибиторов (антиферменты) А. Я. Данилевским с сотр. еще в прошлом столетии. К числу агентов, повышающих активность ферментов, относятся ионы многих металлов и некоторые анионы. Особенно часто активаторами ферментов бывают Mg2+, Мп2+, ?п2+, К+ и Со2+, а из анионов—С1~. В одних случаях ионы металлов входят

111

flj фермент-суВстратный ? комплекс ив образуется

аллостерический стиму-

Dmmop аллостерический ингибитор ингиоитор

Рис. 51. Активирование и ингибирова-ние действия фермента:

а—аллостерический центр фермента; к—каталитическ