а, отличающихся большей терапевтической ценностью. Это—синтез 6-аминопенициллановой кислоты:

' s СН3 Пешпвилив-

/ \ /

СН2 — CO-NH—CH —сн с + н2о 1 I I ГсНз

О

С— N—СН—СООН

БС1ПИЛПСННЦКЛЛИН

s сн3

/\/

->¦ СН, —СООН + H,N— СН—СН С

I I I Ген,

f^^s С—N —СН-СООН

и

Фенвлухсускм Пенициллаиовая кислота

кислота

Присоединяя по ее аминогруппе иные, чем бензил, радикалы, получают пенициллины, отличающиеся специфическими качествами.

Сказанным далеко не исчерпывается список химических производств, базирующихся на применении достижений инженерной энзимологии, имеющей огромное будущее.

Наряду с использованием иммобилизованных ферментов продолжает развиваться переработка химического сырья при посредстве микроорганизмов, которые в этом случае являются как бы живыми ферментсодержащими лабораториями. Наиболее древним химическим производством Такого рода является получение спирта путем брожения, когда примерно полтора десятка ферментов, содержащихся в дрожжевых клетках, с огромной скоростью превращают глюкозу в этиловый спирт. Характерно, что в настоящее время осуществляется интенсивный переход от классических схем бродильной промышленности на новую технологию с использованием иммобилизованных клеток различных микроорганизмов. Так, этанол получают из глюкозы с помощью иммобилизованных в полиакриламидном геле клеток Saccharomyces cerevisiae.

143

Первый в мире промышленный 1000-литровый реактор проточного типа по синтезу L-аспарагиновой кислоты из фумарата аммония был запушен в Японии (1973); в нем использованы иммобилизованные в полиакриламид-ном геле клетки кишечной палочки (Esherichia coli, штамм АТСС № 11303), содержащие аспартат-аммиак-лиазу:

Аспартат-аммиак-лиаза

НООС—СН=СН—COONH4-* ноос—сн2—сн—соон

MgCI (1мМ)

1 NH2

Фумарат аммония Аспарагиновая кислота

Он давал 1915 кг L-аспарагиновой кислоты/сут при 95%-ном уровне превращения в нее введенного фумарата аммония. При подкислении элюата до рН 2,8 и охлаждении до 15° С аспарагиновая кислота выкристаллизовывалась в виде препарата 100%-ной чистоты. Иммобилизованные клетки кишечной палочки сохраняют активность аспартат-аммиак-лиазы на 80% в течение 120 дней и на 50%—в течение 600 дней работы реактора, тогда как интактные клетки—всего в течение 10 дней и на уровне 25% от исходной. Отсюда ясен выигрыш, приносимый иммобилизацией. Годом позже на химическом факультете МГУ им. М. В. Ломоносова была опробована установка с иммобилизованными клетками кишечной палочки (штамм 85), обладающими аспартат-аммиак-лиазной активностью с производительностью несколько килограммов L-аспарагиновой кислоты особой чистоты. Такая установка в научно-исследовательском институте аминокислот (г. Ереван) масштабируется до промышленного уровня.

Другая аминокислота, производство которой налажено в индустриальном масштабе,—L-изолейцин. Ее синтезируют из треонина и глюкозы при посредстве иммобилизованных клеток Serratia marcescens с выходом до 4 г/л элюата с колонки реактора. Аналогичным образом получают еще одну незаменимую аминокислоту—L-лизин:

СН 2—(СН 2) з—СН—СООН+СО 2 ТчН2 Агн2

Лизин

При посредстве иммобилизованных клеток Corynobacterium glutamicum производят L-глутаминовую кислоту из глюкозы; Esherichia coli—L-трипто-фан из индола; Streptococcus faecalis—L-орнитин из L-аргинина. Разработаны также методы синтеза L-аланина, L-фенилаланина, L-метионина и L-треонина тоже с помощью иммобилизованных микроорганизмов. Таким образом, наработка аминокислот L-ряда для питания человека и выращивания сельскохозяйственных животных осуществляется в настоящее время в основном в реакторах с иммобилизованными клетками.

С помощью иммобилизованных в полиакриламидный гель клеток Brevibacterium ammoniagens начиная с 1974 г. в Японии в промышленном масштабе производят яблочную кислоту из фумаровой. У нас в стране отработан регламент получения пропионовой, уксусной и пировиноградной кислот из глюкозы, лактозы или лактата натрия в проточной системе с клетками пропионовокислых бактерий (Propionibacterium shermanii), иммобилизованными в полиакриламидный гель.

Microbactenum

НООС—сн—(сн2)3—сн—СООН-

| | ammoniaphilum

NH2 NH2

Диаминопимелиновая кислота

144

Опробованы на лабораторных установках, а частично и в крупномасштабных вариантах методы синтеза с помощью иммобилизованных клеток различных микроорганизмов АТФ, НАДФ, глюкозо-6-фосфата, глутатиона, глюко-новой и 2-кетоглюконовой кислоты, фруктозы (изомеризацией глюкозы), смеси глюкозы и фруктозы (гидролизом сахарозы), коэнзима А и ацетил-КоА. Недавно японским химикам удалось этим же путем перевести пропилен в оксид пропилена прямым окислением кислородом—это крупное достижение внедрено в практику.

Особо следует упомянуть использование иммобилизованных клеток в фармацевтической промышленности для синтеза стероидных гормонов и их производных, синтеза пенициллинов пролонгированного действия и ряда других лекарственных препаратов. В последнее время развернулись перспективные работы по иммобилизации методами инженерной энзимологии клеток, которым при помощи приемов генетической инженерии придана способность продуцировать важнейшие лекарственные средства—инсулин, интерферон, otj-антитрипсин. К 2000 г. намечено резко увеличить производство лекарственных средств методами генетической инженерии.

Еще одна область применения ферментов—аналитическая химия. Она базируется на изготовлении электродов, покрытых иммобилизованными ферментами. Так, если на платиновый электрод нанести иммобилизованную глюкозооксидазу, то концентрацию глюкозы можно определить, регистрируя амперометрически количество выделяющегося на электроде пероксида водорода:

н н ОН н о

I I I I # Глюкозо-

:—с—с—с—с

HOCHj—с—с—с—с—с + о2 + НаО

| | | | \ оксида а»

ОН он н он н

Глюкоза

Н н они о

I I I I //

—> носн,—с—с—с—с—с + н2о,

I 1 I I \ он он н он он

Глюконовая кислота

Определение высокоспецифично (на электроде реакция идет только с глюкозой) и осуществляется в течение 1 мин. На базе такого ферментного электрода создан автоматический анализатор глюкозы. При помощи ферментных электродов определяют сахарозу, мочевину, этиловый спирт, анализируют загрязнение среды остаточными пестицидами и т. п.

Не исключено, что использование ферментов позволит найти новые источники для добывания энергии. Опыты в этом направлении уже сделаны и наметились два пути решения этой насущной для человека проблемы.

Первый состоит в прямом преобразовании химической энергии в электрическую в топливных элементах, где используются такие ферменты, как глюко-зооксидаза, уреаза, гидрогеназа, формиат- и алкогольдегидрогеназа (субстраты—глюкоза, мочевина, водород, муравьиная кислота и этанол соответственно). В случае алкогольдегидрогеназы в качестве фермента и этанола в качестве субстрата схема получения электрического тока такова:

Алкогольдегидрогеназа

С2Н5ОН+НАД+-> СН3СНО+НАДН + Н+

145

НАДН + Н+ +

soj -

НАД+ +

СН3

Ф еназинметосульфат окисленный (ФМС)

I

4N'

А

so

2-.

н3

Фенаэинметосульфат восстановленный (ФМС'Нз)

На поверхности

ФМС-Н2->ФМС+2Н++2е

платинового электрода

Второй путь сводится к использованию в качестве источника энергии продуктов ферментативной реакции, например водорода, выделяющегося при улавливании энергии солнца (рис. 59). Расчеты показывают, что квадрат размером 200x200 [км], где размещены акцепторы солнечной энергии—иммобилизованные хлоропласты, при КПД, равном 25%, обеспечит РФ энергией и исключит загрязнение внешней среды.

Во многих лабораториях мира ученые настойчиво разрабатывают одну из самых сложных, но вместе с тем практически наиболее важных проблем— проблему механизма ферментативного катализа. Когда она будет полностью решена, современная нам химическая промышленность уступит место совершенно новому химическому производству, основанному на принципе ферментативного катализа,—производству, где с огромными скоростями, 100%-ными выходами, избирательно, без побочных продуктов, в мягких условиях (низкая температура и давление и т.п.) будет осуществляться превращение одних веществ в другие. Более того, полная расшифровка ферментативных механизмов таких процессов, как фотосинтез, биосинтез белков, фиксация молекулярного азота и т. п., и воспроизведение их на этой основе в лаборатории и промышленности могут v^v ">ч^ в корне изменить способы добывания пище-

^""^s^ вого и непищевого сырья и оказать огромное

влияние на образ жизни человечества.

Круг химических процессов, ускоряемых ферментами, необычайно широк, а число их огромно. В природе осуществляется множество ферментативных превращений, еще недоступных воспроизведению в лабораторных условиях. Все это свидетельствует об огромном значении ферментов как истинных двигателей жизненных процессов. Изучая ферменты, мы невольно были вынуждены наряду с описанием их строения и свойств уделить большое внимание ускоряемым ими химическим превращениям. Этим мы сделали первый шаг к изучению ряда конкретных разделов динамической биохимии, изложенных в последующих главах учебника.

2Hjp

Иммобилизованные мороштасты

2<НАДФН + Н+)

(

)

2(НАДФ+)

Иммобилизованная гидрогеназа

2Н2

Рис. 59. Принципиальная схема акцсп тирования солнечной энергии для раз ложсния воды и получения газообраз ного топлива

ГЛАВА IV

КОФЕРМЕНТЫ, ВИТАМИНЫ И НЕКОТОРЫЕ ДРУГИЕ БИОАКТИВНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ

Из числа известных в настоящее время ферментов примерно 40%, проявляют свои каталитические функции в присутствии добавочных соединений небелковой природы—коферментов, или коэнзимов. К числу таких ферментов относятся большинство оксидоредуктаз и трансфераз, все лигазы, значительная часть лиаз и некоторые изомеразы. Лишь гидролазы не нуждаются в коферментах и осуществляют каталический процесс исключительно при посредстве активных центров, образованных аминокислотными радикалами полипептидной цепи фермента. В подавляющем большинстве случаев кофер-менты регенерируются в неизменном виде по завершении каталитического акта, и это отличает их от субстратов ферментативных реакций. Однако в многостадийных химических процессах, ускоряемых ферментами, на определенном этапе кофермент может выступать как субстрат и приходит в исходное состояние лишь по завершении всей цепи реакций или после химических преобразований, ведущих к восстановлению уровня его нормального содержания в клетке. Весьма существенно, что коферментами часто служат витамины. Поэтому обе эти группы биологически активных соединений рассматривают обычно совместно.

КОФЕРМЕНТЫ

Химическая природа коферментов крайне разнообразна. Среди них встречаются органические вещества, относящиеся к алифатическому и ароматическому ряду, а также гетероциклические соединения, как одно-, так и многоядерные. Коферментам нельзя дать единую физико-химическую характеристику, поскольку эта сборная группа соединений, объединенная лишь одним признаком—способностью соединяться с белками—апоферментами с образованием каталитически активных холоферментов.

Термин «кофермент» впервые появился в 1897 г., когда Т. Бертран, изучая свойства лактазы (В-галактозидаза, отщепляющая концевые нередуцирующие остатки в 6-галактозидах), обозначил этим термином активатор этого фермента—Мп . Следующей важной вехой в развитии учения о коферменте было исследование английских биохимиков А. 1ардена и В. Юнга, которые в 1906 г. доказали наличие в ферментном препарате дрожжей—зимазе термостабильного отделяемого ультрафильтрацией фактора—козимазы.

Из энзимов, функционирующих с коферментами в качестве обязательных партнеров каталитических реакций, 675, т. е. почти 85%, используют для этого соединения нуклеотидной природы: НАД* (~165 ферментов), НАДО + (~ 155), и НАД* и НАДФ + <~50), коэнзим А (~80) и АТФ (~225). Они составляют самую многочисленную группу так называемых нуклеотид-ных коферментов. Не менее распространенным коферментом является пи-ридоксалъфосфат, роль которого в реакциях переаминирования рассмотрена ранее (см. с. 127), а функция в процессах декарбоксилирования аминокислот будет освещена позже (см. с. 267). У ряда ферментов коферментами являются ФМН и ФАД, а также соединения хиноидной природы. Химическая природа

147

и роль перечисленных коферментов в каталитических процессах описаны в гл. III.

В качестве коферментов выступают и иные органические соединения. Так, в окислительно-восстановительных реакциях коферментами служат липоевая кислота, глутатион и железопорфирины, в реакциях переноса гликозильных остатков и их производных—нуклеозиддифосфатсахара, в реакциях переноса азотистых оснований при биосинтезе фосфолипидов—цитидиндифосфатхо-лин и т. п. Механизмы их участия в ферментативных процессах рассмотрены в последующих главах. Кроме того, функцию коферментов выполняют многие витамины.

ВИТАМИНЫ

Общее понятие о витаминах и их классификация. Витамины представляют сборную в химическом отношении группу органических соединений, поэтому с точки зрения химического строения им нельзя дать общего определения. Физические свойства веществ, относящихся к витаминам, столь же разнообразны, как и их химическая природа. Физиологическое действие витаминов на животных, растительные ткани и микроорганизмы тоже весьма различно, и отдельные витамины в этом отношении совершенно не похожи друг на друга.

Витамины объединены в отдельную группу природных органических соединений по признаку абсолютной необходимости их для гетеротрофного организма в качестве дополнительной к белкам, жирам, углеводам и минеральным веществам составной части пищи.

В большинстве случаев витамины не синтезируются гетеротрофными организмами и их недостаток сопровождается возникновением патологических явлений.

В количественном отношении потребность в витаминах ничтожна: так, человек в среднем должен потреблять ежедневно около 600 г (в пересчете на сухое вещество) основных питательных веществ и только 0,1—0,2 г дополнительных факторов питания—витаминов.

Отсюда ясно, что витамины в организме выполняют каталитические функции. Во многих случаях, как будет показано ниже, витамины являются составными частями ферментов и необходимы для их функционирования.

В последнее время изучается роль витаминов для автотрофных организмов, в частности растений, где витамины синтезируются. Оказалось, что для жизнедеятельности растений они тоже абсолютно необходимы и выполняют здесь также главным образом каталитические функции. Следовательно, на первый план в характеристике витаминов как особой группы соединений выступает их способность в ничтожных концентрациях обеспечивать осуществление ферментативных процессов.

Таким образом, витамины могут быть охарактеризованы как группа органических веществ, обладающих разнообразным строением и физико-химическими свойствами, абсолютно необходимых для нормальной жизнедеятельности любого организма и выполняющих в нем непосредственно или в составе более сложных соединений каталитические и регулярные функции.

Витамины были открыты в 1880 г. нашим соотечественником Н. И. Луниным. Они привлекли внимание именно как до