макроэргических соединений в трансформации энергии. Рассмотрим теперь, как можно представить механизм превращения стабильной энергии химической связи в подвижную энергию возбуждения молекулы и обратного процесса— преобразования мобильной энергии возбуждения в стационарную энергию химической связи. Именно в этом заключается одна из наиболее существенных функций макроэргических соединений. Молекула АТФ осуществляет указанную трансформацию энергии, будучи связана со специфическим белком. Закрепление АТФ на белковой молекуле сопровождается сближением трифосфатной части молекулы с пуриновой ее частью. Выделяющаяся при распаде макроэргической связи между остатками фосфорной кислоты энергия передается на пуриновую часть молекулы. Она трансформируется при этом в мобильную энергию возбуждения электронов системы сопряженных двойных связей пуринового цикла, откуда поступает далее к месту химической реакции, переводя в возбужденное состояние электроны преобразуемого органического соединения. Это обеспечивает последнему повышенную реакционную способность, создавая, в частности, потенциальную возможность для обратного преобразования подвижной энергии возбуждения в стационарную энергию новых химических связей (рис. 63).

Энергия, которая выделяется при распаде макроэргических соединений и за счет которой может быть совершена та или иная работа, используется не только для химического синтеза. Она может служить в организме для теплообразования, свечения, накопления электричества, выполнения механической работы и т. п. При этом химическая энергия преобразуется в тепловую, лучистую, электрическую, механическую и пр. Принципиально важно то, что преобразование химической энергии в другие ее виды протекает в организме при обязательном участии соединений с макроэргическими связями, в частности АТФ. В молекуле АТФ, как было показано выше, происходит трансформация стабильной энергии макроэргических межфосфатных химических связей

186

Рис. 63. Трансформация энергии в молекуле АТФ (пояснения

в тексте)

в подвижную энергию возбуждения электронов пуриновой части молекулы; это и есть, вероятно, первый этап преобразования энергии в организме. Именно поэтому АТФ занимает центральное место в энергетическом обмене живой материи.

Рассмотрение механизма трансформации и передачи энергии при распаде АТФ и аналогичных ей макроэргических соединений позволяет понять одно из элементарных фундаментальных свойств живой материи. Оно состоит в том, что в системах, обладающих свойствами живого, энергия, необходимая для осуществления химической реакции, будучи высвобождена в одной точке, может быть передана в другую точку, где она непосредственно используется. Это значит, что в живой природе нет необходимости в непосредственном контакте путем соударения (что является характерным свойством реакций в неживой природе) -молекулы, поставляющей энергию, с молекулой, нуждающейся в энергии. Это принципиально отличает ход химического процесса в живых объектах от такового в неживых.

В живой природе идет непрерывный процесс запасания энергии в виде химической энергии связей органических веществ. Он состоит главным образом в преобразовании лучистой энергии в химическую (фотосинтез зеленых растений) и в небольшой мере—в переходе химической энергии из неорганических соединений в органические (хемосинтез микроорганизмов).

Как видно из рис. 64, АТФ играет выдающуюся роль как при запасании, так и при расходовании энергии, т. е. является ключевым веществом в энергетическом обмене организма. Известно много реакций, при посредстве которых АТФ возникает из других макроэргических соединений, и наоборот, есть много процессов, приводящих к синтезу макроэргических соединений при участии АТФ. Такие, например, макроэргические соединения, как кре-атинфосфат, фосфоенолпировиноградная кислота и 1,3-дифосфоглицериновая кислота, при взаимодействии с АДФ образуют АТФ с выделением креатина,

187

Рис. 64. Превращения энергии в живой природе (пояснение в тексте)

пировиноградной кислоты и 3-фосфоглицериновой кислоты. Эти и подобные им соединения принято обозначать как АТФ-генерирующие вещества. Перечисленные реакции обратимы, и при известных условиях равновесие может быть смещено в сторону распада АТФ.

Общие закономерности трансформации энергии в живых системах. Обмен энергии в процессе жизнедеятельности не исчерпывается превращением химической энергии в другие виды ее и наоборот (рис. 64); он носит более широкий характер. Так, в палочках и колбочках сетчатки глаза световая энергия превращается в электрическую; в специфических структурах внутреннего уха звуковая и гидродинамическая энергия переходит в электрическую и т. п.

Трансформация одного вида энергии в другой осуществляется в организмах в морфологически разнообразных элементах—хлоропластах, мышцах (российские кардиологи недавно впервые выявили новые пути передачи энергии от места ее образования в митохондриях к точке потребления в миофиб-риллах сердечной мышцы), рецепторных аппаратах тканей и органов, сетчатке глаза, люминесцентных органах и т. п.

Однако всем этим разнообразным элементам свойственны некоторые общие черты строения. Они отличаются наличием двухслойных мембран с высоким содержанием липопротеинов в них и присутствием структурного белка, связывающего в упорядоченные образования достаточно унифицированные элементарные частицы. Последние включают в свой состав молекулы определенного строения, которые, собственно, и осуществляют процесс трансформации энергии. При этом энергия одного вида поглощается молекулой-преобразователем и превращается в энергию другого вида. Простейшим примером механизма внутримолекулярного превращения энергии молекулой-преобразователем служит переход стационарной энергии химических связей трифосфат-ной группировки молекулы АТФ в подвижную энергию возбуждения электронов ее пуриновой части (см. рис. 63). Более сложным примером являются конформационные изменения белковых молекул в процессе преобразования одного вида энергии в другой (например, мышечное сокращение).

Обмен веществ и энергии представляет единый, неразрывный процесс, где видоизменение вещества всегда сопровождается выделением или поглощением свободной энергии и где выделившаяся или поглотившаяся в том или ином количестве энергия обеспечивает распад или синтез химических связей, т. е. по существу видоизменение самих веществ. Таким образом, закономерности обмена веществ и энергии в живой природе являются частным случаем общего закона сохранения материи и энергии.

ГЛАВА VI

НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И ИХ ОБМЕН

СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Химия нуклеиновых кислот в последнее время развивается необычайно быстрыми темпами, что связано с коренным пересмотром взглядов на биологическую роль этих соединений. Представление о нуклеиновых кислотах как об инертных структурных элементах ядра и цитоплазмы оставлено навсегда, так как нуклеиновым кислотам принадлежит очень важная роль в обеспечении специфического синтеза биополимеров в организме человека, животных, растений и микробов.

К нуклеиновым кислотам относят высокомолекулярные соединения, характеризующиеся определенным элементарным составом и распадающиеся при гидролизе на пуриновые и пиримидиновые основания, пентозу и фосфорную кислоту. Особенно характерно для нуклеиновых кислот содержание Р (8— 10%) и N (15—16%). Нуклеиновые кислоты содержат также С, Н и О.

Нуклеиновые кислоты были впервые выделены Ф. Мишером более столетия тому назад (1869) из ядер клеток гноя в виде соединения с белком— нуклеина (от лат. nucleus—ядро), а сам термин предложен А. Косселем в 1889 г. К концу прошлого века они были получены Р. Альтманом (1899) в свободном от белка состоянии из животных тканей и дрожжей, а в 1936 г. А. Н. Белозерским с сотр.—из растительного материала.

Выделение нуклеиновых кислот. Большая часть нуклеиновых кислот в растительных, животных и бактериальных клетках находится в соединении с белками. Поэтому, кроме разрушения клеточных оболочек путем гомогенизации биологического материала, для выделения нуклеиновых кислот необходимо разорвать связь между нуклеиновой кислотой и белком. Это достигается обработкой материала крепким раствором соли, например 10%-ным раствором NaCl. Одновременно осуществляется извлечение нуклеиновых кислот. После удаления твердого остатка нуклеиновые кислоты осаждают из охлажденного до 0° С раствора этанолом или раствором трихлоруксусной кислоты. Осадок нуклеиновых кислот отделяют центрифугированием, тщательно промывают и высушивают.

Кроме того, применяют фенольный метод выделения нуклеиновых кислот, при помощи которого можно получать их нативные препараты. Для этого измельченную в гомогенизаторе при охлаждении ткань заливают водонасы-щенным раствором фенола, энергично встряхивают смесь в течение 1 ч и центрифугируют ее. При этом содержимое центрифужной пробирки разделяется на четыре четко отграниченных друг от друга разных по консистенции и цвету слоя. В верхнем, водном, слое и подстилающем его вязком слое белого цвета сосредоточена основная масса нуклеиновых кислот. В третьем, желеобразном, прозрачном, желтоватом слое находится фенол с растворенными в нем белками. Четвертый, самый нижний, слой коричневого цвета содержит остатки ткани, денатурированные белки и ничтожную примесь нуклеиновых кислот.

189

Так как в процессе выделения нуклеиновых кислот этим методом удается избавиться от значительной части белков (протеинов), указанную процедуру называют фенольной депротеинизацией.

Освободить препараты нуклеиновых кислот от белка можно также путем обработки их солевого экстракта двойным объемом хлороформа, содержащего немного изоамилового спирта; после тщательного перемешивания в течение 15 мин до получения стойкой эмульсии смесь центрифугируют и отделяют верхнюю водную фазу, содержащую нуклеиновые кислоты (денатурированный белок остается на границе водного и хлороформного слоев); нуклеиновые кислоты из водной фазы осаждают двойным объемом охлажденного этанола.

Полученные так суммарные препараты нуклеиновых кислот фракционируют далее, используя более тонкие методы, такие, как хроматография, в том числе аффинная, фильтрация через гели агарозы и сефарозы, распределение в двухфазных полимерных системах, ультрацентрифугирование, электрофорез и др. Большинство этих методов рассмотрено в гл. II и при работе с нуклеиновыми кислотами отличается лишь в деталях. В итоге получают препараты индивидуальных нуклеиновых кислот.

Выделение из биологических объектов давно уже не является единственным методом получения нуклеиновых кислот. Наряду с ним широкое распространение получил их химический синтез. Разработка химических и инженерных подходов позволила создать автоматические синтезаторы нуклеиновых кислот, отличающиеся высокой производительностью и надежностью. Так, одна из марок синтезаторов фирмы ЛКБ (Швеция) обеспечивает автоматическую сборку молекул нуклеиновых кислот длиной до 160 звеньев при десятиминутной длительности каждого цикла..

Особенно важен химический синтез нуклеиновых кислот для получения генов, их фрагментов, регуляторных участков нуклеиновых кислот и т. п. Первый синтез гена аланиновой транспортной рибонуклеиновой кислоты был осуществлен в 1972 г. Г. Корана. Сейчас число синтезированных генов достигло нескольких десятков. В СССР синтезированы ген человеческого интерферона а2(М. Н. Колосов и др., 1982), ген валиновой транспортной РНК (М. Н. Колосов и др., 1983), ген кальцитонина человека (А. А. Баев и др., 1985), ряд промоторов и др.

Химический состав. При нагревании нуклеиновых кислот с хлорной кислотой они распадаются на структурные единицы, из которых построены их громадные молекулы. Другие кислоты, как, например, НС1, вызывают очень резкую деструкцию нуклеиновых кислот с выделением NH3, свидетельствующим о разрушении входящих в их состав структурных элементов.

Среди структурных элементов нуклеиновых кислот найдены пиримидино-вые основания, пуриновые основания, углеводы и фосфорная кислота.

Пиримидиновые основания являются производными гетероциклического соединения —пиримидина:

н

Структурная форму- Межатомные расстоя- Порядки связей в

ла пиримидина ния, нм, и величины молекуле пирнми-валентных углов в дина молекуле пиримидина

190

Приведенная здесь структурная формула в виде шестичленного цикла с чередующимися двойными связями является, как и в случае бензола, лишь данью истории. В действительности, как можно заключить из сопоставления межатомных расстояний, в молекуле пиримидина нет ни типичных двойных, >. ни типичных простых связей, а имеет место взаимодействие тс-электронов всех «составляющих цикл атомов. Мерой взаимодействия тс-электронов служит так называемый порядок связи, характеризующий силу сопряжения л-электронов -двух соседних атомов. В случае типичной двойной связи силу взаимодействия тс-электронов, т. е. порядок связи, принимают за единицу. В результате дело-кализации тс-электронов в молекулах с сопряженными двойными связями, как, например, в рассматриваемой молекуле пиримидина, порядки связей принимают дробные значения. Чем больше значение порядка связи, тем сильнее выражена ее способность к реакциям присоединения.

В составе нуклеиновых кислот найдены следующие производные пиримидина (пиримидиновые основания): цитозин, ураиил, тнмин, 5-метилцитозин и 5-оксиметилцитозин:

но

он

но n

Урмои (2, 4-диоксипк-римидин)

nh,

Тнммн

(5-меттуршил)

но n 5-истилцитоаи

nh,

СН,

Jx\,ch2oh

XT

но n

5-ожсиыстхлцнтоанн

Цитозин (2-оксн-4-аиино-пиримидин)

Цитозин, урацил и тимин содержатся в нуклеиновых кислотах в значительных количествах, а 5-метилцитозин и 5-оксиметилцитозин—в ничтожных и далеко не всегда. Поэтому они называются минорными (экзотическими) основаниями. По аналогии с редкими аминокислотами в составе белков их можно было бы назвать иногда встречающимися в составе нуклеиновых кислот основаниями. В последние годы список минорных оснований пирими-динового ряда, обнаруженных в составе нуклеиновых кислот, пополнился (табл. 15).

Пуриновые основания нуклеиновых кислот являются производными бицик-лического гетероцикла—пурина:

н =

I

н

0,625

Межатомные расстояния в молекуле пурина, нм

Порядки связей в молекуле пурииа

Пиримидиио- Имидазоль-вый цикл ный цикл Структурная формула пурина

Здесь, как и в случае пиримидинового цикла, расстановка в формуле простых и двойных связей условна. Как межатомные расстояния, так и порядки связей в молекуле пурина указывают на высокую степень сопряжения тс-электронов атомов С и N, составляющих пуриновый цикл.

191

В гидролизатах нуклеиновых кислот всегда обнаруживаются два производных пурина—аденин и гуанин:

nh,

н

Аденин (6-аминопурин)

к/

ОН

h,n-^n^n/

н

Гуанин (2-амино-б-оксипурин)

Кроме того, в составе нуклеиновых кислот найдено большое число минорных пуриновых оснований—метилированных производных аденина и гуанина (табл. 15):

н,с—

NH

1 -Метиладеннн

Н3С/ 2—Мети ладен ни

HgC-N-CHs

Nj-Диметиладенин

1-Мети лгу анин

7-Метнл гуанин

Ы2-Днметнлгуаннн

Важной особенностью оксипроизвод