ор), вокруг которого навита биспиральная ДНК (18 левых сверхвитка, 146+2 н. п., шаг— 2,75 нм); тетрамер гистонов (Н3)2 -(Н4)2 определяет укладку центрального витка суперспирали ДНК в желобе белкового кора, а два гетеролимера (Н2а-Н2в) участвуют в упаковке остальной части суперспирали ДНК по ~0,5 витка каждый; эти ги-стопы называют коровыми гистонами; гистон HI стабилизирует области входа и выхода ДНК в нук-леосому, взаимодействуя с линкерной ДНК (от 10 до 80 и. п.), соединяющей нуклеосомы друг с другом

(рис. 73). Цепочка нуклеосом образует, в свою очередь, спираль второго и последующих порядков, вплоть до конденсации в хромосому (рис. 74, А). При этом (рис. 74, Б) на один оборот спирали в нуклеосоме приходится уже 80 н. п. (уплотнение ДНК в 6—7 раз), в солениде (6 нуклеосом на виток)— 1200 н. п. (уплотнение в 40 раз), в каждой петле хроматина—60000 н. п. (уплотнение в 680 раз) и в хромосоме—1,1 *106 н. п. (уплотнение в 1,2-104).

Существенно, что переход ДНК в суперспиральное состояние и обратно осуществляется при посредстве особой группы ферментов—топоизомераз, т. е. ферментов, изменяющих пространственную структуру.

Свойства ДНК. ДНК—вещества белого цвета, волокнистого строения, плохо растворимые в воде в свободном состоянии, но хорошо растворимые в виде солей щелочных металлов. Они также хорошо растворяются в крепких солевых растворах.

Так как молекулы ДНК резко асимметричны, их растворы обладают высокой вязкостью и двойным лучепреломлением. Имея большой отрицательный заряд, молекулы ДНК подвижны в электрическом поле. Все ДНК оптически активны.

При нагревании растворов ДНК в интервале температур от 80 до 90° С происходит «плавление» нуклеиновых кислот, сопровождающееся изменением вязкости раствора и возрастанием поглощения в ультрафиолетовой части спектра (при 260 нм). Последнее получило наименование пшерхромного эффекта.

В химическом отношении ДНК довольно инертны, благодаря чему их долгое время считали индифферентными структурными элементами клеточного содержимого. Однако постепенно накопились данные о ряде химических реакций, свойственных нуклеиновым кислотам: они прочно связывают многовалентные ионы металлов, причем Си2+ и Ме4+ дают с ДНК нерастворимые комплексы. В первую очередь поливалентные катионы вступают в реакцию с N и О гуанина. Возможно, ионы металлов принимают участие в поддержании третичной структуры нуклеиновых кислот.

Нуклеиновые кислоты легко вступают во взаимодействие с полиаминами, например со спермидином [H2N—(CH2J3—NH—(СНг)4—NH2] и спермином [H2N—(СНг )з—NH—(CH2 )4—NH-—(СН2 )з—NH2 ], которые участвуют в поддержании третичной структуры нуклеиновых кислот. Одной из важных реакций ДНК является алкилирование аминогрупп А, Ц и Г. Не меньшее значение имеет дезаминирование перечисленных азотистых оснований: в первую очередь дезаминируются Г и Ц. И алкилирование, и дезаминирование ДНК лежат в основе работ по химическому мутагенезу, т. е. по изменению наследственности при помощи химических средств.

211

Метафазная хромосома

Суперспираль (200 нм в диаметре)

Соленоид (30 нм в диаметре)

^Хроматиновая нить (10 нм в диаметре)

Гистоны

Биспираль Нуклео- Суперспираль Диффузный ДНК сомный нуклеосом хроматин тяж (соленоид)

Кластеризованный хроматин

1400 нм

1400 нм

ч с

TV

700 нм

/

Конденсированный хроматин

Хромосома

Рис. 74. Уровни суперспирализации ДНК в хроматине:

А—динамика суперспирализации ДНК—белкового комплекса: Б—степень уплотнения ДНК в процессе суперспирализации (см. текст на с. 211).

Структура и функции транспортных РНК. Транспортные РНК были впервые выделены из так называемой «растворимой» части клетки, т. е. из надосадоч-ной жидкости клеточного гомогената. Главной функцией этого вида рибонуклеиновых кислот оказалась способность акцептировать аминокислоты и переносить их в белоксинтезирующий аппарат клетки—рибосому. В связи с этим их называют транспортными рибонуклеиновыми кислотами (тРНК).

Фракция растворимых РНК, составляющая 1% от сухого вещества клетки или 10% от суммарной клеточной РНК, очень сложна по составу. Она включает несколько десятков индивидуальных тРНК, каждая из которых получена в гомогенном состоянии.

Так как каждая из индивидуальных тРНК способна переносить единственную аминокислоту в процессе белкового синтеза, конкретные тРНК называют по имени той протеиногенной аминокислоты, которую она акцептирует (например, глициновая тРНК, аланиновая тРНК, лизиновая тРНК и т. д., или сокращенно тРНКгли, тРНКала, тРНК™3 и т. п.). Если одна и та же аминокислота акцептируется несколькими индивидуальными тРНК, то последние называют изоакцепторными и нумеруют (например, тРНКаал, тРНК!3" и т. п.). Так, обнаружено 4 изоакцепторных тРНКлей, 3 тРНКпро, по 2 у тРНКсер, тРНКмет, тРНКала, тРНК™3, тРНКтир, тРНКгли и тРНКтре.

Химический состав тРНК оказался своеобразным лишь в одном отношении: по сравнению с другими видами РНК они богаты минорными нуклеотид-ными остатками. Именно в составе тРНК найдены минорные азотистые основания, перечисленные в табл. 15. Более того, тРНК содержат нуклеозиды и нуклеотиды своеобразного строения, как, например, псевдоуридин и неогу-аниловая кислота:

он

сн2он

он

0=Р—о—сн

он

ж он

Псевдоуридин

Ж ОН Неогуаниловая кислота

Список минорных компонентов тРНК непрерывно расширяется и в настоящее время насчитывает около 50. Минорные нуклеотидные остатки составляют примерно 10% всех нуклеотидных звеньев тРНК, причем значительная часть их (4—5%) представлена псевдоуридиловой кислотой. Предполагают, что минорные нуклеотидные остатки защищают тРНК от атаки рибонукле-азами, что имеет существенное значение, так как тРНК функционируют в растворимой части клетки. Кроме того, есть мнение, что некоторые из них принимают участие, в кодировании аминокислот и важны для «узнавания» ферментом (аминоацил-тРНК-синтетазой) той тРНК, которая взаимодействует с определенной аминокислотой в процессе активирования последней. Что касается соотношения обычных азотистых оснований в составе тРНК, то оно характеризуется отчетливо выраженным преобладанием суммы Г и Ц над таковой А и У. Таким образом, тРНК относится к ПД-типу РНК.

Как отмечено выше, молекулярные массы тРНК лежат в пределах 17000— 35 000. В большинстве случаев они сосредоточены в более узком диапазоне, от 22000 до 27000, т. е. тРНК содержит от 70 до 80 н. о.

Благодаря тому, что в процессе работы по исследованию первичной структуры тРНК Р. Холли с сотр. удачно применили рибонуклеазу, отличающуюся

213

специфичностью к гуаниловым нуклеотидным остаткам, к деструкции дрожжевой тРНКала (при 0° С, рН 7, в присутствии Mg2+), им удалось получить несколько крупных блоков, содержавших от 10 до 39 н. о., и далее расшифровать первичную структуру каждого из них. В результате была впервые (1965) установлена полная первичная структура аланиновой тРНК из пекарских дрожжей (рис. 75). За последующие 5 лет была расшифрована первичная структура 16 тРНК, за следующие пять—47, еще за пять—115 тРНК и ряда предшественников тРНК, причем первичные структуры тРНК?ал и тРНКЦ" из дрожжей выяснены в нашей стране академиком А. А. Баевым с сотр. в 1967 и 1971 гг. соответственно. Эти данные охватывают тРНК, выделенные в основном из бактерий и дрожжей, но в ряде случаев касаются тРНК, полученных из высших организмов (млекопитающих, растений, насекомых и др.). Всего на апрель 1993 г. выяснена последовательность нуклеотидных остатков в 2011 тРНК, изолированных из представителей животного и растительного царства, а также из микроорганизмов.

Массовые данные, полученные в результате исследования первичной структуры тРНК, позволили выявить ее некоторые общие закономерности. В 75% случаев молекулы тРНК открываются остатком гуанозин-3', 5'-дифосфата и во всех случаях завершаются ЦЦА-триплетом, причем остаток концевого адено-зина служит для связывания (акцептирования) аминокислоты:

В первичной структуре изученных тРНК представлены гомологичные блоки, крайне близкие по чередованию нуклеотидных остатков. Особенно ярко это выявляется в дигидроуридиловой и псевдоуридиловой петлях (рис. 75). Так, в псевдоуридиловой петле у всех без исключения исследованных тРНК присутствует тетрануклеотидный фрагмент—ГТЧУЦ—; дигидроуридиловая петля является сосредоточием остатков не только дигидроуридиловой кислоты, но и АГ-последовательностей, а также минорных оснований.

Закономерно распределены в первичной структуре тРНК также минорные нуклеотидные остатки. Это объясняют тем, что только некоторые позиции в молекулах тРНК доступны действию метилирующих ферментов, с помощью которых осуществляется модифицирование обычных оснований в метилированные производные на уровне уже полностью сформированной молекулы.

Вторичная структура тРНК ясна из рассмотрения рис. 75. Ее характерной особенностью является спирализация полинуклеотидной цепочки самой на себя в строго фиксированных комплементарных зонах.

Таких зон насчитывают 4 или 5 в зависимости от наличия или отсутствия добавочной петли, которая всегда располагается, если она есть, между анти-кодоновым отростком и псевдоуридиловой петлей. В результате ограниченной биспирализации возникает однотипная для всех тРНК вторичная структура в виде клеверного листа (см. рис. 75).

Ц—Ц—в цепь

H2N—CH—СО — О ОН

R

Аминоацил-тРНК

214

IV

У

(Р)Г-

г-г Ц" г-

У

г-

А У

(2Н) У

ц

У

р мТ

цгцг

Г У

<2Ш

ГЦГЦ 1 м?Г

у.

Ц.

ц-

3'

А (ОН)

Ц

Ц

А

Ц

ц

У

г

ц

У

Ц У У

АГГЦЦ А

:::::/// г УЦЦГГ ц

ц т

У(2Н)

3'

А I

Ц

Л

I

Пир Пир

Л1УР^.

Пир

\

о i

У Ч> У " И

и г ц

Пур —

Пир Пир

Пир—о.

i \ III Пур /

Пир \ Ц

• • • • г

•ч

о \

Пур

/

Анти одон

• - основания, связанные водородными связями о - неспареиные основания Пур-пуриновое основание Пир-пиримидиновое основание

Рис. 75. Структура тРНК:

А—первичная н вторичная структуры аланиновой тРНК; Б—обобщенная структура тРНК в виде клеверного листа; Ч*—остаток псевдоуридиловой кислоты; м*Г—остаток Nj-метилгуаниловой кислоты; м|Г—остаток N2-диметилгуаниловой кислоты; м'И-остаток Ni-метилинозиновой кислоты; И—остаток инозиновой кислоты, У(2Н)—остаток дигидроуридиловой кислоты; /—дигидроуридиловая петля; //—антикодоновая петля; ///—псев-доуридиловая петля; IV—акцептирующий конец; V—добавочная петля; •—основания, связанные водородными связями; О—неспаренные основания; Пур—пуриновое основание; Пир—пиримидиновое основание

В период наивысшего расцвета модели тРНК типа клеверного листа каждой ее отграниченной части приписывали строго определенное функциональное значение. Особенно большую роль в выяснении функций тех или иных полинуклеотидных последовательностей в молекуле тРНК сыграл метод разрезанных молекул, предложенный в лаборатории акад. А. А. Баева и образно названный акад. В. А. Энгельгардтом методом хирургии молекул. Сущность его сводится к расщеплению в молекуле тРНК ферментативным или химическим путем ограниченного числа межнуклеотидных связей, разделении полученных фрагментов и реассоциации из них молекул тРНК, дефицитных по одному из фрагментов. Реассоциация молекул тРНК из того или иного набора ее фрагментов идет при участии сил слабых взаимодействий и осуществляется по принципу самосборки. Испытание биологической активности таких молекул показало, что представления об однозначной роли дигидроуридиловой, псевдоуридиловой и других петель и частей молекулы тРНК не вполне справедливы. Например, за связывание аминоацил-тРНК-синтетазы отвечает не только дигидроуридиловая петля, но и другие участки молекулы тРНК.

Решение проблемы функциональной активности как фрагментов, так и целой молекулы тРНК, безусловно, связано с прогрессом в изучении ее третичной структуры. На основании расшифровки рентгенограмм, выполненных при разрешении от 0,6 до 0,25 нм, построены модели молекул ряда тРНК, в частности тРНКфен дрожжей, кишечной палочки и термофильных бактерий, тРНКасп, тРНКтрн, формилметиониновой тРНК кишечной палочки и многих других тРНК. Наиболее детально отработана А. Ричем третичная структура дрожжевой тРНКфен (рис. 76).

215

Рис. 76. Третичная структура дрожжевой фенилаланиновой тРНК:

А—Схематическое изображение. Арабскими цифрами указаны номера нуклеотидных остатков. Молекула имеет Г-образиую форму, причем антикодовая петля и акцептирующий конец находятся, как и в плоскостной модели типа клеверного листа, на противоположных концах молекулы. Дигидроуридиловая и псевдоуридиловая петли вследствие их взаимодействия друг с другом и образования водородных связей между комплементарными азотистыми основаниями сближены и находятся на сравнительно небольшом расстоянии от продольной оси молекулы. Биспиральные структуры остаются прекрасно выраженными в антикодоновой и акцептирующих частях молекулы. В функциональные взаимодействия тРНК с ферментом, рибосомой и субстратами вовлекаются нуклеотидные остатки, расположенные в различных частях нуклеотидной цепи, но сближенные в процессе формирования пространственной структуры молекулы. В какой-то мере это напоминает механизм возникновения активных центров в молекулах белков. Б—пространственная модель

АуГ1

ггаццуу

II

.г - у-*о

%

во •« (A-V

^.АцууггГ* ЦУГЦАУЦУГАЦУГГЦААГЦ A УцГГГЦ^Л ^ГУЛГЛЦУГЛ1ТГЭТУГ^ ТЯ

—_«-------------ЛГИ?|.

A U

-Ха—

У г

•-V-J

г-ц г-ц V- г . У Ц-1К0

1U0

Гц Ц A I w*r АГ ^АЛЛУАЦГАГЦ ЦЦУУ УЦНУУУГУ 'цццГГУп Г II- 11 1111 И--........1111-Зи

ЛГГГГ АГГАААй /ГГЦЦг" I Ml

гууг угцуиг

-г г1

ггаг

те

цл

I

1М0

??!«-•» \'а

АУГАГААУ1" f 11 I • I I

Г—Ц/ЮО

:?=siry

I__tf»Si/> г г-ц-

^ v vAB*~Vy-

III

1ГАЦУУУУГАДГ'. ___jqp_ iqqd_Аг Г —U

уд

яо-а

Ч.у*'

У—А

г f-u.

А Я» 83

ч?» if У*-И» \ Г ГУЦГАЦУ1 \ АА IIIIIII

аг««г„ \ 7ц-А Ф,

г^гацуугДуу ....... V»-

гц.а

ЖО-А А.

Vй*

ууг'ЧуЛ, ^§л^« Г»

X г."

\ АА\ААА

.ААУУГЖЦГГГГЦЦЦП|АЦАА17\Л|УЛ

' 11 -III111 ЧГ.4

' УГУУЦЦГГГЦ

шо

н Ц.- -ill XV "ушит. ГУАУГУГЦ V1

АГЦЦУГ А угцлч\г

a in- ип^

".lirrrv А11Г V Ы

r-uot

i

у-* г

Г-* у

ГЦГГГУ АЦ1

*гГу»

ЭбвГ^йа !2Г~гп*?=Ьад,«

^ W

у-г

я» ИГ?-1" ио

«¦ГГЦЦУЦУУГ АГГГГГАУ**ЦУАЦУГ«' „ U ¦¦¦¦I 11-11 IIII-I а

УуЦЦГГГГАГ Ц UU УЛ ГАУГГЦ.

" а» а V

""\ur_

В*уг-:

Рис. 77. Предполагаемая вторичная структура 16S рРНК кишечной палочки, выведенная на основании максимального спаривания комплементарных оснований:

/—/Г—домены, существенные для понимания закономерностей становления ее третичной структуры (их границы указаны

сплошными и пунктирными линиями)

217

Для тРНК характерны неканонические функции, которым в последнее время уделяют все большее внимание: сигнальная в геноме вирусов; нематричного (внерибосомального) переноса аминокислотных остатков на растущие при биосинтезе пептидогликанов клеточной стенки бактерий или существующие полипептиды при участии аминоацил-тРНК-протеинтрансфераз; затравочная для обеспечения действия обратной транскриптазы (см. ниже) и др.

Структура и функции рибосомальных РНК.