На долю рибосомальных РНК (рРНК) приходится основная масса клеточной РНК (80—85% от тотальной РНК клетки). У всех организмов найдено три вида рРНК, различающихся по молекулярным массам и локализации в рибосомах (см. гл. VII), обязательной составной частью которых они являются. Две рРНК высокомолекулярны, а третья сравнительно низкополимерна. Кроме того, в рибосомах эукариот присутствует еще одна низкомолекулярная рРНК.

В зависимости от класса рибосом (70S или 80S) константы седиментации и молекулярные массы двух (большой и малой) высокополимерных рРНК несколько различаются. Малая молекула высокополимерной рРНК (константа седиментации 16,0—18,0S, Л/=0,55 • 106-0,79 • 106) локализована в 30— 40S, а большая (константа седиментации 23—29S, М = 1,07 ¦ 106 —1,6 - 10б)—в 50—60S субчастицах рибосом.

Во всех без исключения рибосомах присутствует низкополимерная 5S рРНК с молекулярной массой 40 тыс. Да. Она локализована в 50—60S субчастицах рибосом. Низкополимерная рРНК с константой седиментации 5,8S (Л/~50000) характерна только для эукариотических рибосом.

Нуклеотидный состав высокополимерных рРНК варьирует в довольно широких пределах и по мере усложнения организма все более смещается в сторону преобладания ГЦ-пар. РНК, выделенные из рибосом митохондрий, отличаются резким преобладанием АУ-пар, что является одним из аргументов в пользу выделения митохондриальных РНК в особую группу. Высокомолекулярные рРНК содержат в 2—5 раз меньше минорных оснований, чем тРНК, и список их гораздо короче.

Нуклеотидный состав 5S рРНК своеобразен—в нем совершенно не представлены метилированные основания и лишь в некоторых случаях (например, у дрожжевых грибков) обнаружена псевдоуридиловая кислота (около 1,3 мол. %). Соотношение главных нуклеотидов у 5S рРНК характеризуется отчетливым ГЦ-типом.

В последние годы наметились большие успехи в познании первичной и вторичной структур рРНК. Прежде всего это касается 5S рРНК. Их первичная структура выяснена уже более чем в 500 случаях. Во всех исследованных до сих пор 5S рРНК, за единичными исключениями, найдено ровно 120 н. о., чередование которых в определенной, но небольшой мере варьирует у 5S рРНК из разных источников, что используется в химической таксономии. Ниже представлена первичная структура 5S рРНК кишечной палочки:

10 20 30 40 50

(р)УГЦЦУГГЦГГЦЦ1^АГЦГЦГГУГГУЦЦЦАЦЦУГАЦЦЦЦАУГЦЦт

60 70 80 90 100 ПО

АААЦГЦЦГУАГЦГЦЦГАУГГУАГ^

(20

ГЦАУ(он)

Расшифрована также первичная структура нескольких десятков 5,8S рРНК и их предшественников. В подавляющем числе они содержат 158 н. о.

218

Большие успехи достигнуты в установлении первичной структуры 16;—18S рРНК. Впервые в 1974 г. Ж. Эбель (Франция) сообщил данные о первичной структуре 16S рРНК кишечной палочки. Вслед за этим была выяснена первичная структура более ста 16—18S рРНК. Число нуклеотидных звеньев в 16S рРНК кишечной палочки (рис. 77)—1542, в 18S рРНК печени крысы —1874. Завершены аналогичные исследования 23S рРНК кишечной палочки, 25S рРНК пекарских дрожжей и ряда других. 23S рРНК кишечной палочки включает 2904 н. о., 28S рРНК печени крысы—4718 н. о. Всего на апрель 1993 г. выяснено расположение рибонуклеотидных звеньев у 1850 16—18S рРНК (у 100—из археобактерий, у 1400—из эубактерий и хлоропластов, у 350—из эукариот), а также у 23—28S рРНК, выделенных из 150 представителей про-и эукариот.

Вторичная структура рРНК характеризуется спирализацией самой на себя полирибонуклеотидной цепи как у низко-, так и у высокополимерных рРНК.

Спирализация идет за счет взаимодействия комплементарных (Г—Ц и А—У) оснований, в результате чего в молекулах рРНК возникает то или иное количество биспиральных участков. Оно достаточно существенно в молекулах 5S и 5,8S рРНК и несколько менее выражено в молекулах 16—18S рРНК. Вторичную структуру 5S рРНК иллюстрирует рис. 78, А.

219

сплошная черная линия—поглощение при 260 нм в пробах после разделения 23S, 16S и 4S РНК ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы: пунктирная линия—включение 14С-урацила в РНК. Ход пунктирной кривой показывает, что максимальное включение предшественника осуществляется в РНК с коэффициентом седиментации около 8S которая

Рис. 79. Доказательство существования быстрометящейся РНК (мРНК):

и представляет собой мРНК

Дно

0

Верх пробирки

Плоскостные биспирализованные и линейные участки молекул 5S и 16S ] рРНК, в свою очередь, укладываются в более компактные структуры высшего порядка, т. е. образуют пространственную, третичную структуру этих молекул. Она детально охарактеризована у 5S рРНК (рис. 78, Б) и пока еще далека от окончательного выяснения у 16—18S рРНК. Тем не менее и у последних нет уже сомнения в том, что осуществляется мощная компактизация постоянных и вариабельных доменов.

Функциональная роль всех видов рРНК постепенно проясняется: 16—18S и 23—29S рРНК являются структурной основой для формирования рибонуклео-протеинового тяжа, который, складываясь в пространстве, дает начало 30— 40S и 50—60S субчастицам рибосомы. Однако этим, конечно, не исчерпывается роль высокополимерных рибосомальных РНК: они могут взаимодействовать с мРНК и аминоацил-тРНК; их участки, видимо, распознаются белковыми факторами (см. гл. VII), принимающими участие в сборке полипептидной цепи в рибосоме; не исключено непосредственное взаимодействие друг с другом или контакт через посредство специфических белков 16—18S рРНК и 23—29S рРНК, локализованных в разных субчастицах, в процессе образования 70—80S рибосом при ассоциации субчастиц или в транслирующей рибосоме. Что касается 5S и 5,8S рРНК, то их функции в должной мере пока еще не изучены. Определенно установлено лишь, что 5S рРНК в рибосомах бактерий связана с тремя белками—L5, L18 и L-25 (о рибосомных белках см. ниже, гл. VII), у археобактерий—с одним-двумя, у эукариот—только с одним (L8); эти комплексы рассматривают как третью субчастицу рибосомы, в составе которой 5S рРНК выполняет роль посредника между пептидилтрансферазным центром и EF—G—связывающими доменами (об этом тоже см. гл. VII).

Структура и функции информационных РНК. Существование информационных рибонуклеиновых кислот (иРНК), или РНК-посредников, в передаче информации от ДНК в белоксинтезирующий аппарат клетки (мессенджер-РНК, от англ. messenger—посыльный, курьер, мРНК) было предсказано А. Н. Белозерским и А. С. Спириным в 1958 г„ исходя из наличия корреляции между нуклеотидным составом ДНК и РНК.

Двумя годами позже образование мРНК у бактерий было доказано Ф. 1ро и сотр. в прямых опытах с включением импульсной метки в различные виды РНК (рис. 79). Это позволило в новом свете истолковать более ранние эксперименты Е. Волкина и Л. Астрахана (1956), наблюдавших появление быстрометящейся фракции ДНК-подобной РНК у бактерий после заражения их фагом.

Прямое выделение мРНК было осуществлено в 1962 г.— Е. Баутц и Б. Холл для этого применили остроумный метод сорбции мРНК, возникающей при заражении кишечной палочки фагом T4, на ДНК, выделенной из этого фага и ковалентно связанной с фосфоцеллюлозой. В дальнейшем метод

220

аффинной хроматографии стал ведущим при выделении и очистке мРНК, особенно после того, как в составе большинства мРНК эукариот был обнаружен полиадениловый фрагмент значительной протяженности, а в качестве носителя в колонках применена сефароза, ковалентно связанная с полиуриди-ловой кислотой цианбромидным методом. Взаимодействие полиадениловых последовательностей мРНК с полиуридиловыми фрагментами носителя в силу комплементарности первых и вторых приводит к связыванию на такой колонке только мРНК.

Благодаря применению разнообразных методов и приемов многие мРНК получены в высокоочищенном состоянии. К их числу принадлежат мРНК, обеспечивающие матричный биосинтез субъединиц гемоглобина, яичного альбумина, легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов, гистонов, кристаллинов (белки хрусталика глаза), миозина, фиброина шелка, авидина, протаминов, а-казеина и др. Суммарное содержание мРНК в клетках составляет 2—3% от тотальной клеточной РНК.

Молекулярные массы мРНК варьируют в широких пределах: от нескольких сотен тысяч до нескольких миллионов дальтон. Так, молекулярная масса моноцистронной глобиновой мРНК, служащей матрицей для биосинтеза субъединиц гемоглобина, составляет 150000 (константа ее седиментации равна 9S). Молекулярные массы многих моноцистронных, т. е. кодирующих биосинтез одного белка, мРНК близки к этой величине. Однако у полицистронных мРНК, кодирующих биосинтез не одного, а нескольких функционально взаимосвязанных белков, молекулярные массы гораздо выше и достигают нескольких миллионов дальтон. Примером может служить полицистронная мРНК гистидинового оперона, выделенная из салмонеллы. Ее молекулярная масса равна 4 • 106. Впрочем, некоторые моноцистронные мРНК могут обладать молекулярной массой такого же порядка, что характерно, например, для мРНК фиброина шелка (М = 5 ¦ 106).

Нуклеотидный состав мРНК крайне разнообразен. Для бактериальных мРНК характерно ДНК-подобие нуклеотидного состава, тогда как у мРНК эукариот этого не наблюдается. В ряде случаев содержание нуклеотидов в мРНК крайне специфично. Так бывает, в частности, при кодировании ими биосинтеза резко асимметричных по аминокислотному составу белков. Ярким примером может служить фиброиновая мРНК. В ее составе содержится 40 мол. % гуанина и 19 мол. % цитозина, что вполне соответствует наличию в фиброине шелка 42% глицина.

Первичная структура ряда мРНК выяснена. Так, в составе глобиновой мРНК человека установлено чередование 576 н. о. (не считая полиаденилового фрагмента), овальбумина цыпленка—1859, липопротеина внешней мембраны кишечной палочки—332; известны первичные структуры глобиновых мРНК кролика и африканской шпорцевой лягушки, ряда вителлогениновых (кодируют биосинтез запасного белка яиц) мРНК, нескольких десятков мРНК, кодирующих биосинтез белков хориона яиц насекомых, и т. п.

Строение мРНК специфично: в их составе есть информативные, т. е. работаю-, щие как матрицы в процессе биосинтеза белка, зоны и неинформативные участки. Из неинформативных участков изучены уже упоминавшиеся ранее полиадени-ловые фрагменты, находящиеся на З'-конце молекулы мРНК. Длина полиадениловых фрагментов у разных мРНК колеблется от 50 до 400 н. о. Эти фрагменты отсутствуют в молекулах гистоновых мРНК. Неподалеку от полиаденилового фрагмента в молекулах мРНК располагаются небольшие повторяющиеся последовательности длиной примерно по 30 н. о., тоже не несущие кодирующей функции, но, возможно, являющиеся акцепторными участками при взаимодействии мРНК с рибосомой или отдельными белковыми факторами. Кроме того,

221

на 5'-конце мРНК присутствует нуклеотидная последовательность, азотистые основания в которой метилированы, а один из нуклеозидных остатков—7-метилгуанозин, присоединен через трифосфатную группировку. Эта часть молекулы мРНК также неинформативна и называется шапочка или кэп (от англ. cap—кепка, шапка):

Отмеченное своеобразие в строении РНК выражается в виде такой обобщенной структуры:

5'h

,АУГ

КЭП Неинформативный фрагмент (30-100 нуклеотидных остатков)

Информативный (транслируемый) фрагмент

УГА

уаа'

нз'

Неинформативный Поли а фрагмент (50-400 (100-1000 нуклеотидных нуклео-остатков) тидных остатков)

Полагают, что полиадениловая часть молекулы мРНК участвует в процессе созревания мРНК (см. ниже), предопределяет время жизни мРНК, способствует переносу мРНК из ядра в цитоплазму и принимает участие в трансляции (см. гл. VII) мРНК. Кэп нужен для защиты мРНК от эк-зонуклеаз, для связывания белковых факторов при взаимодействии с рРНК в рибосоме, он играет сигнальную роль при присоединении мРНК к рибосоме и участвует в трансляции.

Вопрос о вторичной структуре мРНК находится в стадии разработки. Как и у других видов РНК, полинуклеотидная цепь в молекуле мРНК спирализована сама на себя. Данные о возможных спариваниях в молекуле мРНК комплементарных оснований (А—У и Г—Ц), заложенные в компьютер, послужили основанием для разработки модели глобиновой мРНК кролика (рис. 80). Что касается третичной структуры мРНК, то о ней пока ничего не известно и можно лишь констатировать, что она упакована менее компактно, чем рРНК.

На заре изучения мРНК, когда исследовали преимущественно бактериальные мРНК, характерным для этого вида РНК считали быструю обменива-

222

Рис. 80. Компьютерная модель вторичной структуры Р-глобиновой мРНК кролика.

Информативный фрагмент (см. рис.) включает 441 н. о.: неинформативная зона со стороны кэпа—56 н. о. (от кэпа до инициирующего колона, с которого начинается сборка полипепгиднов цепи р-глобнна) со стороны полиаденилового фрагмента, не считая его,—94 н. о. (от терминирующего кодона, при посредстве которого завершается сборка полипептидной цепи р г юбина до начала полиадениловой части мРНК) Примерно 40% комплементарных нуклеотидов в составе р-глобиновой мРНК кролика, как и в других мРНК. спарено, что показано точками; в этих зонах мРНК снирализована ' сама на себя

емость, т. е. короткое время жизни, исчисляемое секундами или минутами, ДНК-подобие нуклеотидного состава, а также значения молекулярных масс, которым соответствуют константы седиментации в промежуточной зоне между константами седиментации транспортных (4S) и малой рибосомальной (16S) РНК. Исследования мРНК эукариот решительно изменили эти критерии отнесения РНК к классу информационных. Дело в том, что мРНК эукариот оказались достаточно долгоживущими молекулами (от нескольких часов до нескольких дней и даже недель), их нуклеотидный состав был далек от соотношения нуклеотидных остатков в валовой ДНК, а коэффициенты седиментации варьировали от 9S до 65S. Поэтому в настоящее время перечисленные критерии отпали ввиду их неадекватности свойствам всех мРНК и остался единственный критерий, сводящийся к следующему: информационной следует считать ту РНК, которая в последовательности нуклеотидных остатков в молекуле несет информацию, обеспечивающую синтез специфического белка непосредственно на ней самой. Таким образом, матричные свойства данной РНК оказались единственным признаком, который имеет всеобщее значение.

ОБМЕН НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Изучение обмена нуклеиновых кислот представляется принципиально важным в системе подготовки учителей на химико-биологических и биолого-химических факультетах пединститутов, так как круг вопросов, которые при этом рассматриваются, далеко выходит за рамки биохимии нуклеиновых кислот и позволяет дать современную трактовку проблемам наследственности, изменчивости, естественного и искусственного мутагенеза, систематики и эволюции.

Изучение обмена нуклеиновых кислот имеет огромное значение и в другом аспекте. Оно исключительно важно для глубокого понимания процессов жизнедеятельности организмов. Исследование молекулярных механизмов биосинтеза пуриновых и пиримидиновых оснований позволило открыть ряд важнейших закономерностей в регуляции новообразования этих соединений и сформулировать некоторые общие принципы регуляции обмена веществ. Раскрытие механизма специфического биосинтеза огромных молекул полинук-леотидов, при осуществлении котор