ого с изумительной точностью обеспечивается порядок чередования мононуклеотидных звеньев, их составляющих, привело к признанию ведущей роли в этом процессе взаимодействия комплементарных пуриновых и пиримидиновых оснований. Это, в свою очередь,

223

дало возможность впервые понять интимный механизм обеспечения специфического воспроизведения первичной структуры макромолекул при их биосинтезе. Данные о регуляции новообразования нуклеиновых кислот привели к фундаментальным открытиям, позволяющим сделать первые шаги к объяснению закономерностей не только воспроизведения специфических макромолекул, но также и морфогенеза.

Пути распада нуклеиновых кислот. Распад нуклеиновых кислот в организме идет достаточно энергично. Так, период полужизни молекул ДНК в тканях мыши составляет от 1 до 5 суток; период полужизни большинства мРНК у эукариот—несколько суток, а у прокариот—всего несколько секунд.

Нуклеиновые кислоты (РНК и ДНК) распадаются в организме при посредстве особых ферментов—нуклеаз. Они ускоряют реакцию разрыва меж-нуклеотидных фосфодиэфирных связей в молекулах нуклеиновых кислот и принадлежат, следовательно, к более широкой категории ферментов— фосфодиэстераз.

Нуклеазы, действующие на внутренние межнуклеотидные связи в молекулах ДНК и РНК, называются эндонуклеазами. При их участии осуществляется деполимеризация нуклеиновых кислот в основном до олигонуклеотидов. Нуклеазы, ускоряющие реакции последовательного отщепления нуклеотидов от РНК, ДНК или их фрагментов, начиная с конца полинуклеотидной цепи, называют экзонуклеазами. Они обеспечивают распад нуклеиновых кислот до свободных нуклеотидов.

В зависимости от специфичности действия среди нуклеаз различают рибо-нуклеазы и дезокснрибонуклеазы. Первые ускоряют реакции распада как внутренних, так и внешних (концевых) межнуклеотидных связей в молекулах РНК. Вторые выполняют такую же функцию по отношению к ДНК. Вместе с тем существует большая группа неспецифических эндо- и экзонуклеаз, действующих одновременно и на РНК, и на ДНК.

По характеру действия на фосфодиэфирные связи в молекулах нуклеиновых кислот нуклеазы делят на две категории. Одни из них ускоряют реакцию гидролиза сложноэфирной связи межнуклеозидного фосфата с 3'-углеродным атомом остатка рибозы или дезоксирибозы, а другие—с 5'-углеродным атомом. Поэтому в названиях указанных ферментов всегда подчеркивается, гидролиз какой из связей ускоряет данная нуклеаза. Однако ведущим признаком является локализация фосфата в составе олиго- или мононуклеотидов, возникающих в результате гидролиза нуклеиновой кислоты. Поэтому нуклеазы, расщепляющие связь Р—5'С, называются З'-нукле-азами, а расщепляющие связь Р—З'С именуют 5'-нуклеазамн:

224

Важнейшими группами нуклеаз являются следующие.

Дезокснрибонуклеазы I (дезоксирибонуклеинат-5'-олигонуклеотидгидрола-зы) ускоряют гидролиз фосфодиэфирных связей в ДНК между остатком фосфата и З'-углеродным атомом остатка дезоксирибозы: ДНК + (и — 1) Н20-*и олигодезоксирибонуклеотидов.

Представителями ДНКаз I являются панкреатические ДНКазы (М~31000). Первичная структура панкреатической ДНКазы быка расшифрована: она представлена одной полипептидной цепью из 257 аминокислотных остатков. Оптимум рН лежит между 6,8 и 8,0. Фермент активируется ионами Мп2+ и Mg2+ и ингибируется анионами, связывающими указанные катионы, а также олигонуклеотидами. Механизм действия панкреатических ДНКаз на ДНК таков, что вначале осуществляются в основном разрывы фосфодиэфирных связей в одной из цепей ДНК. Парные разрывы очень редки, поэтому деполимеризация идет не сразу. Конечный продукт переваривания ДНК панкреатической ДНКазой содержит следы дезоксирибонуклеозид-5'-фосфатов, немного динуклеотидов и большое количество олигодезоксирибонуклеотид-5'-фосфатов, составленных в среднем из 4 мономерных звеньев. Панкреатическая ДНКаза быка существует в виде четырех множественных форм.

Дезокснрибонуклеазы II (дезоксирибонуклеинат-З'-олигонуклеотидгидро-лазы) в качестве конечного продукта действия образуют олигодезоксирибону-клеотид-З'-фосфаты со средней длиной молекул в 6 звеньев и небольшие количества дезоксирибонуклеозид-З'-фосфатов. Молекулярная масса ДНКазы II селезенки 38 ООО, оптимум рН 4,5—5,5. Ее молекула состоит из 343 аминокислотных остатков и содержит углеводную компоненту, структурной единицей которой является глюкозамин. Фермент активируется ионами Mg2+, ингибируется ионами SO2.-, РО%~, AsOl-, АУ-кополимером, тРНК. Деполимеризация ДНК осуществляется путем парных разрывов фосфодиэфирных связей в молекуле ДНК, в результате чего быстро накапливаются ее большие фрагменты; особенно хорошо атакуются связи, составленные из парных сочетаний ГГ и АЦ. Предполагают, что ДНКазы II являются димерами.

Кроме ДНКазы I и II существует большая группа эндонуклеаз, атакующих как дву-, так и одноцепочечную ДНК. Так, например, у кишечной палочки их 7, среди них—4 низкомолекулярные (12—33 тыс. Да) и 3 высокомолекулярные (68—114 тыс. Да).

Экзодезоксирибонуклеазы ускоряют реакцию гидролиза молекул ДНК с образованием дезоксирибонуклеозид-5'-фосфатов. Из кишечной палочки выделено и очищено в разной степени 8 экзодезоксирибонуклеаз (I—VIII), отличающихся друг от друга по определенным показателям. В частности, эк-зодезоксирибонуклеаза III (М = 30000) обладает способностью отщеплять 3'-фосфат, если он есть, от концевого нуклеотида фрагментов молекулы ДНК.

Рестриктазы—ДНКазы бактериального происхождения, расщепляющие чужеродные (фаговую) ДНК в строго определенных зонах, которые «узнаются» ферментом. Эти зоны имеют палиндромную структуру. Ниже приведены два примера, где стрелками указаны точки гидролиза фосфодиэфирных связей:

l

5'—ГААТТЦ—3'

3'—ЦТТААГ—5' Т

рестриктаза кишечной палочки I (ЕсоЯ/); М = 116 ООО, тетрамер (29 ООО х 4)

I

5'—НЦЦАГГН —3' 3'—НГГТЦЦН—5'

рестриктаза кишечной палочки II (EcoRIl); М = 80 ООО, димер (40О00 х 2)

8—3502

225

В зависимости от взаимного расположения места узнавания и точки расщепления ДНК рестриктазами, их относят к I типу (сайт узнавания далеко, на расстоянии сотен н. о. от точки расщепления), II типу (расщепление внутри сайта узнавания) или III типу (расщепление вблизи сайта узнавания). К 1993 году выделено и охарактеризовано 2393 рестриктазы I типа, 188 рестриктаз II типа и только 4 рестриктазы III типа. Всего следовательно изучено 2585 рестриктаз.

Так как рестриктазы расщепляют ДНК на ограниченное число фрагментов, они нашли применение для определения первичной структуры ДНК. Однако еще более важная область их практического использования — генетическая инженерия, так как именно благодаря действию рестриктаз из ДНК выщепля-ются фрагменты, которые далее встраиваются в бактериальную ДНК, становятся интегральной частью бактериального генома и приносят бактерии новые, не свойственные ей ранее биохимические признаки, такие, например, как способность синтезировать интерферон, инсулин и другие белки, находящие широкое применение в медицине (рис. 81). В принципе, такие процессы возможны и в геноме высших организмов. Легкое встраивание рестрикционных фрагментов ДНК в реципиентную ДНК (т. е. ДНК, включающую эти фрагменты в свой состав) объясняется тем, что при действии рестриктаз в точке разрыва молекулы ДНК получаются «липкие», комплементарные концы. Ввиду огромной теоретической ценности и большого практического значения этих работ в нашей стране начиная с 1975 г. осуществляются комплексные исследования по проекту «Рестриктаза», который планируют на последующих этапах работы превратить в более широкий проект «Нуклеаза» и привлечь к его разработке различные научно-исследовательские институты. В 1980 г. большая группа советских ученых была удостоена 1осударственной премии за разработку регламентов получения 30 рестриктаз и внедрение их в практику работ по генетической инженерии.

Рибонуклеазы I (рибонуклеинат-З'-пиримидино-олигонуклеотидгидрола-зы)—эндонуклеазы, ускоряющие реакцию гидролиза РНК по пиримидино-вым нуклеотидным остаткам. Ранее их относили к рибонуклеат-нуклеотидо-2'-трансферазам циклизующим, но, поскольку 2', З'-циклофосфаты в процессе их действия образуются как промежуточные продукты, гидролиз которых до З'-фосфатов ускоряется тем же ферментом, в настоящее время рибонуклеазы (РНКазы) I включены в класс гидролаз.

Представителями РНКаз I являются панкреатические РНКазы, выделенные из многих объектов. Установлена первичная структура панкреатической РНКазы быка, свиньи, овцы, жирафа, марала, косули, северного оленя, лани, шиншиллы, мыши, крысы, морской свинки, одногорбого верблюда и нутрии. Во всех случаях, за исключением двух последних, фермент состоит из 124 аминокислотных остатков. Выяснена третичная структура некоторых панкреатических РНКаз. Панкреатические РНКазы могут быть однокомпонентными (рибонукле-аза А) и дьухкомпонентными (рибонуклеаза В, содержащая углеводный остаток сМ= 1350). Механизм действия их на РНК детально исследован и является ярким дополнением к материалам гл. III, касающимся механизма действия ферментов.

Полипептидная цепь РНКазы, замкнутая четырьмя дисульфидными мостиками (рис. 82,А), принимает вследствие этого пространственную конфигурацию (рис. 82, Б), в определенной мере предопределяющую третичную структуру (рис. 82, В) этого фермента. Понять механизм действия панкреатической РНКазы помогли данные о структуре ее активного центра (рис. 82, Г). В нем связываются участки молекулы РНК, содержащие в своем составе пиримидиновые (цитидиловые и уридиловые) нуклеотидные остатки, причем парные сочетания ЦА, ЦГ, ЦЦ и ЦУ атакуются в пропорции

226

Чужеродная ДНК

Расщепление рестриктазой

Включение фрагмента чужеродной ДНК • плазмидную ДНК

Плазмидная ДНК

Прцняхноаение плазмиды JL > бактериальную \/ клетку-хозяина

Шазмкщваа ДНК

Размножение бактерий

Рис. 81. Принципиальная схема проведения работ по генетической инженерии

В качестве фрагментов чужеродных ДНК используют гены, ответственные за биосинтез биологически значимых белков; ах экспрессия может быть использована для биосинтеза этих белков после интеграции плазмидной ДНК в бактериальный геном или для клонирования генов ¦ их последующей экспрессии в иных, чем бактериальные, белокситлезирующих системах

Сала—ала—лиз—феи —глу ала—тре (Н2К)Лиз-глу-'

10 -—\ 20 -арг-гли-f гис+мет-асп-сер-сер-тре-сер— ала—ала

"1

70

асн-

глн -цис -тир-глн-сер лир -сер-тре-мет -

тре I

гли

глн—ала —вал —цис —сер

-лиз-цис-ала I

вал

«0

-глн -лиз -асн

ала—цис—глупо

иле —вал I

иле I

гис

| 100 лиз—глн — ала — асн —тре

-гис —вал—фен +тре |-асн-

124

(НООС)вал -сер I

ала I

асп

гли —асн-про -тир—вал-про-вал (гис^фен ¦

тре-лиз-тир-цис —ала-асн-про-тир-лиз

арг-асп-лиз-тре-лей -асн-арг-

сер 1

\ сер ¦

иле 1 1 сер 1

1 тре 1 1 асн 1

асп 1 тир

цис | 1 ц.ис

I арг i асн 1

1 глу i глн 1

1 сер 1 мет 1

1 тре • мет зо 1

1 -гли лиз

1 сер

вал — про^-лиз f цис 40

А

124

Рис. 82. Структура бычьей панкреатической рибонуклеазы и ее активного центра:

А—первичная структура; черными прямоугольниками обозначены—S—S-свнзи, арабскими цифрами—номера аминокислотных остатков, пунктиром обведены аминокислотные остатки, входящие в состав активного центра; Б—расположение в пространстве полипептидной цепи; В—трехмерная модель молекулы при разрешении в 0,5 нм; зачернена впадина, на дне которой располагается активный центр; Г—структура активного центра, в кодором радикалы гис, лиз, фен, сер и тре (их порядковые номера

3000:500:240:27. В активном центре фермента остаток пиримидинового нукле-отида РНК размещается таким образом, что пиримидиновое основание закрепляется в субстратном центре за счет водородных связей с радикалами тре и сер, занимающими 45-е и 123-е положения в полипептидной цепи и за счет гидрофобного взаимодействия с радикалом фен (120-й аминокислотный остаток). Вследствие этого остаток фосфата, расположенный между З'-углеродным атомом рибозы пиримидинового нуклеотида и 5'-углеродным атомом соседнего в цепи РНК нуклеотида, фиксируется между 12-м и 119-м остатками гис каталитического центра. Фиксации межнуклеозидного фосфата в этом положении способствует также радикал лиз, занимающий в молекуле РНКазы 41-е положение, но расположенный в ее активном центре на расстоянии 0,5 нм от вышеупомянутых остатков гис. Вслед за этим наступает непосредственно каталитический акт, осуществляемый в результате согласованной передачи протонов и сводящийся к разрыву межнуклеотидной фосфатной связи, образованию 2', З'-циклофосфата рибозы пиримидинового нуклеотида и по-

228

д

Рис. 82. Продолжение

в полипептидной цепи указаны цифровыми индексами) сближены на расстояние в несколько десятых долей нанометра; Д—

пространственная структура активного центра

следующего гидролиза 2', З'-циклофосфатной связи с восстановлением исходной структуры активного центра (см. схему реакции).

Существенно, что именно остатки гис, находящиеся в 12-м и 119-м положениях в полипептидной цепи и сближенные в каталитическом центре фермента, обеспечивают перенос протонов.

Эта функция имидазольных радикалов гистидина воспроизводится при рассмотрении механизма действия многих других ферментов, особенно гидролаз (см раздел о гидролизе пептидной связи—с. 263, гликозидной связи—с. 331).

Гуанилрибонуклеазы (рибонуклеинат-З'-гуанило-олигонуклеотидгидрола-зы) ускоряют гидролиз связей по 5'-углеродному атому рибозы остатка гуани-ловой кислоты и межнуклеотидного фосфата в молекуле РНК, образуя гуано-зин-З'-фосфат и олигонуклеотиды с остатком гуанозин-З'-фосфата в качестве концевого нуклеотида. Первичная структура гуанилрибонуклеазы, выделенной из плесневого гриба аспергилла (Тх-РНКаза), расшифрована (М = 11 ООО; 104 аминокислотных остатка).

Фермент нашел широкое применение для деструкции РНК при определении их первичной структуры, и именно при посредстве Т^-РНКазы Р. Холли с сотр. (1965) впервые получили крупные фрагменты тРНКала (см. с. 213).

Охарактеризовано еще 10 эндорибонуклеаз, выделенных из бактерий, микроскопических грибов, растений и животных.

Как и в случае ДНКаз, существует большая группа (более десяти) экзорибо-нуклеаз, ускоряющих реакции отщепления рибонуклеотидов по концевым остаткам РНК, и олигорибонуклеотидов, возникающих при селективном гидролизе РНК под действием эндорибонуклеаз. Таким образом, в результате деятельности разнообразных нуклеаз нуклеиновые кислоты при распаде дают сложную смесь индивидуальных рибо- и дезоксирибонуклеозид-3' и 5'-фосфатов.

Кроме перечисленных ферментов в деструкции нуклеиновых кислот принимают участие еще некоторые энзимы, не являющиеся гидролазами фосфоди-эфирных межнуклеотидных связей, например полинуклеотидфосфорилаза и урацил-ДНК-гликозидаза.

Полинуклеотидфосфорилаза (полинуклеотид: ортофосфат-нуклеотидил-трансфераза) в отличие от всех ранее рассмотренных ферментов, участвующих в деструкции нуклеиновых кислот, является нуклеотидилтрансферазой, т. е. переносит нуклеотидные остатки с З'-конца РНК на неорганический фосфат с образованием нуклеозиддифосфатов (НДФ):