p>U итидин -5- дифосфат

NH,

ОН он

НО—Р-О-Р—О—CHj О. Фер.евт II » » \уУ \_

2Н

Промежуточное соединение с двойной связью между 2* и з'-углероднымн атомами остатка рибозы

Н Н Н4к_/Н

ОН Н

Дезоксицитидин-5-дифосфат

Донором атомов Н для восстановления рибозы при превращении рибонук-леозиддифосфата в дезоксирибонуклеозиддифосфат служит специальный белок—тиоредоксин. Будучи составлен из 108 аминокислотных остатков, тиоре-

238

доксин содержит в 32-м и 35-м положениях остатки цис и располагает, следовательно, двумя HS-группами. Именно они и поставляют атомы Н, образуя дисульфидный мостик. Окисленный тиоредоксин немедленно переводится в восстановленную форму, получая атомы Н от НАДН при посредстве фермента тиоредоксинредуктазы.

Кроме обеспечения атомами Н реакции восстановления остатка рибозы, тиоредоксин в восстановленном состоянии способен соединяться с двумя Другими каталитически активными белками Бх и Б2. Последние при этом активируются и непосредственно ускоряют процесс восстановления остатка рибозы. Они же подвержены сильному влиянию других алло-стерических регуляторов активности, в частности АТФ, ГТФ, ТТФ, дАТФ, дГТФ и др.

Таким образом, превращение рибонуклеозиддифосфатов в дезоксирибо-нуклеозиддифосфаты идет в соответствии со следующей схемой:

Mg3+: бслки-ферненты

Рибонуклеознд- Б,(2«В7000)и Б»(2«43000) Дезоксирибо-

дифосфаты ~>«v нуклеозид- ¦

дифосфаты

Тиоредоксин (SH)3 Тиоредоксин (SS)

Тиоредоксинредуктаза

НАД"1" НАДН+Н+

Что касается реакций аминирования (переход от УТФ к ЦТФ) и метилирования (переход от дУМФ к дТМФ), то в первом случае источником аминогруппы у бактерий служит NH3, а у млекопитающих—глн, причем введение аминогруппы осуществляется сопряженно с распадом АТФ; во втором случае источником метильной группы является Ы5-метилтетрагидрофолиевая кислота, а реакция переноса ее ускоряется тимидилат-синтазой (димер; каждая полипептидная цепь—316 аминокислотных остатков; первичная и третичная структуры расшифрованы).

В результате всех этих реакций обеспечивается создание в организме фонда свободных пиримидиновых нуклеозидтрифосфатов (УТФ, ЦТФ, дЦТФ, дТТФ), необходимых для синтеза ДНК и РНК.

Важной особенностью биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов является саморегуляция этого процесса. Установлено, что такие конечные продукты биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов, как ЦТФ и дЦТФ, ингибируют деятельность аспартат-карбамилтрансферазы—фермента, ускоряющего первую реакцию в цепи тех взаимодействий, которые приводят к формированию пиримидинового цикла. Выявлено, что понижение активности фермента вызывается присоединением ЦТФ по аллостерическому центру фермента. Таким образом, накопление в клетке избыточного количества ЦТФ и дЦТФ немедленно сказывается на активности аспартат-карбамилтрансферазы и биосинтез пиримидиновых нуклеотидов замедляется. Антагонистом ЦТФ в ингибирова-нии деятельности этого фермента является АТФ, активирующая фермент. Следовательно, торможение или стимулирование биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов зависит от соотношения в клетках организма АТФ и ЦТФ, т. е. от

239

энергетического баланса клетки, от уровня в ней обмена веществ, в частности от уровня реакций окислительного фосфорилирования, при посредстве которых высвобождающаяся в процессе окисления органических веществ энергия запасается в макроэргических связях АТФ.

Двусторонний контроль деятельности первого в цепи реакций биосинтеза фермента представляет очень четкий механизм регуляции обмена веществ и используется во многих системах биосинтеза в организме. Именно на примере биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов он исследован наиболее детально.

В заключение отметим, что одно из производных пиримидиновых нуклеотидов, а именно 3'-азидо-2', З'-дидезокситимидин, подавляет развитие ретро-вирусов, в том числе вызывающих синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД):

N3 Н

Аэиотгивддан

Предложены и другие производные нуклеотидов для борьбы с этим грозным заболеванием.

Перейдем теперь к рассмотрению механизма биосинтеза пуриновых оснований. Формирование пуринового кольца сразу идет на рибозо-5-фосфате. Поэтому первой реакцией является взаимодействие глутамина с 5-фосфорибозил-1-пирофосфатом при каталитическом воздействии гликозилтрансферазы, ускоряющей перенос остатка 5-фосфорибозы на амидогруппу глутамина. Видимо, одновременно протекает гидролиз возникающего 5-фосфорибозилглутамина, вследствие чего выделяется 5-фосфорибозиламин:

он I

р-он + (н^с-сн„-сн2—сн-соон + н2о 1! s ill и

NH, Глутамин

5-Фосфорнбозил-1- пирофосфат

ОН

НО-Р-О—CHj^O. NH2

0 О

ОН он 5-Фосфорибозиламин

Аыидофосфо-рнбоэилтрэнс-фераэа

ОН ОН

+ но—с—сн 2—сн2—(j;h— у-р—о—р—он

NH,

Глутаминовая кислота

-р—о—f

о о

Пирофосфат

240

В присутствии АТФ при участии специфической лигазы (аминосинтетаза) к 5-фосфорибозиламину присоединяется глицин, причем возникает пептидная связь:

НОч

0=р-0—СН2 О. N

НО^ / >ч

Н

Фосфорибозял-

глицннамид-сивтетаза

5-Фосфорибозиламин

Глицин

ноч

0=Р—О—СН2 .О. NH—СО—CH2NH2

но^ \s /X

+ АДФ + Н3Р04

Н

ОН ОН

5 -Фосфор и бозилг л и ци н а м и д

Молекула 5-фосфорибозилглицинамида удлиняется на один углеродный атом при посредстве фосфорибозилглицинамид-формилтрансферазы. Ее ко-ферментом служит тетрагидрофолиевая кислота, присоединяющая форми-льную группировку по атому азота, занимающему 5-е положение в молекуле кофермента.

С N-формилтетрагидрофолиевой кислоты осуществляется перенос форми-льного остатка на H2N-rpymry 5-фосфорибозилглицинамида. Получившийся в результате этой реакции 5-фосфорибозилформилглицинамид взаимодействует с глутамином в присутствии сопряженно распадающейся АТФ и соответствующей лигазы (см. два первых уравнения на схеме 3 (с. 242)).

Продуктом реакции является производное, где карбонильный кислород пептидной связи замещен на иминогруппу. Затем в результате ряда преобразований возникшего при этом соединения замыкается имидазоль-ный цикл. Данный процесс также идет сопряженно с распадом АТФ и ускоряется специфическим ферментом, который, будучи выделен и очищен, характеризуется относительно невысокой устойчивостью к денатурации.

Весьма существенно, что реакция, в результате которой образуется имида-зольная часть будущего пуринового остатка, практически необратима в отличие от подавляющего большинства остальных стадий рассматриваемого процесса.

Вслед за этим на имидазольном цикле путем ряда ферментативных реак-. ций отмеченного выше типа из аспарагиновой кислоты, С02 и формиата строится пиримидиновое кольцо, т.е. в конце концов создается пуриновый нуклеотид. Схема, включающая главные этапы этого синтеза, такова:

241

он

о=р-о-сн2 он

JHj-NHj

Фосфорябозил глицин-

?н

v СНя-NH

V. he.

NH «мяд-фориялтравс- 0=P—0—СН2

ОН

ферязя

Н

но он

5-Ф осфорибозил-глицннамнд

H Н

НО он

\ ~^н

NH

/-—ч -1---1

X ch5n|h

hn±=c c^hjJ НООС-СНЧСНг)^^ + атф+н2о

ноос-сн-(сн2)5С^01+адф+н3ро4

(но,

С—N ОН H2N-C^ ltt 0=Р-О-СН2^ п. N

он

соон

н т"т н \

но он \

соон сн,

(HjNK

он

H,N-C.

о=р-о-сн2^о он

V

-N

сн

CH-NH-C^ АТФ+HC-^NHj]

но он

ООН

СООН C-N ОН H2N-C^CH •0=P-O-CH, ^rw N ОН

он

S

iooH

nh-c

I^IC—N

адф+Н3РО4

0=P-0-CHa^0. OH

CH

—N

не Jl CH

н2о

OH

0=P-0-CH,

I

OH

^1

N N

н

H H

H

HO OH

H H

н>я<н

HO OH

Инозин-5-фосфат (ИМФ)

Схема 3. Механизм биосинтеза пуриновых нуклеотидов

Если подытожить, из каких соединений строится пуриновый цикл, то окажется, что он возникает из очень простых веществ:

242 «

I------1

I Из оксида I I углерода I "V iiv) /-¦

4 (IV) '

i Из аспарагиновой \ (; ^ Из глицина

ГуЧ-N

кислоты

I гН—-т—J

? Из глутамииа Из формиата

Из приведенной схемы ясно, что 1-й атом азота пуринового цикла ведет свое происхождение от аспарагиновой кислоты, 3-й и 9-й—от глутамина, а 7-й—от глицина. Что касается происхождения атомов углерода пуринового кольца, то видно, что источниками их явились формиат (2-й и 8-й атомы углерода), глицин (4-й и 5-й) и С02 (6-й атом). Химические уравнения, приведенные на схеме 3, показывают детали включения тех или иных атомов N и С из состава перечисленных соединений в пуриновую часть нуклеотида в процессе его биосинтеза.

Пиримидиновое кольцо пиримидиновых нуклеотидов синтезируется в организме из аналогичных соединений: NH3, О02 и аспарагиновой кислоты. Таким образом, исходные вещества для биосинтеза пуриновых и пиримидиновых оснований в организме исключительно доступны, всегда присутствуют в ием, так как аммиак, формильная группа и оксид углерода (IV) образуются в процессе деструкции разнообразных органических соединений или поступают в организм извне, а глутаминовая и аспарагиновая кислоты и их амиды представляют первичные в большом объеме синтезируемые аминокислоты, что имеет большое значение для обеспечения беспрепятственного синтеза этих важнейших для организма соединений.

Как следует из схемы 3, пуриновые нуклеотиды в результате последовательных реакций наращивания пуринового цикла на рибозо-5-фосфате возникают в виде инозин-5'-фосфата. Последний способен окисляться в ксан-тозин-5'-фосфат. В результате аминирования первого синтезируется аденозин-5'-фосфат, а второго—гуанозин-5'-фосфат. И тот и другой процессы ускоряются специфическими ферментами (см. уравнение реакции на с. 244)..

В свою очередь, пуриновые нуклеозидмонофосфаты превращаются далее в нуклеОзидтрифосфаты. При этом гуанозин-5'-фосфат переходит в гуанозин-5'-трифосфат по двойной обменной реакции с АТФ:

ГМФ+АТФ -> ГДФ + АДФ

Нуклеюид-монофосфапиназа

ГДФ + АТФ -> ГТФ+АДФ

Нуклсозиддифосфаттиназа

При взаимодействии аденозин-5'-фосфата с АТФ возникает аденозиндифос-форная кислота; эта реакция открыта А. В. Котельниковой в начале 60-х годов нашего века:

Аденлл тютя

АМФ+АТФ -> 2АДФ

243

он I

НАД++ HjO (j>H HO^N^^N

-—— 0=P—O-

НАДН+Н+ OH

ИМФ - дегидрогеназа

-N II

,CH

он он

Ииозни-51-фосфат

Фумаровая кислота + ГДФ + H3P04

Аспарагиновая /кислота + ГТФ Аденилосукцинат-синтетаза; Дденилосукцинат-

NHa

лиаза

"ЧАЛ

он ОН Аденозин -5'- фосфат

ЬН ОН Ксантозин-51- фосфат

Глутаминован кислота +

Глутамин +

/АТФ + н2о

Ксантозин - 5-фос-фат: L-глутамин

АМФ + Н4Ра07 |амидолитаза (обра-он зующая АМФ)

It

-N

ОН ОН Гуанозин- 5*-фосфат

Она служит субстратом при окислительном фосфорилировании, в результате которого запасы АТФ в организме непрерывно пополняются, что обеспечивает достаточное ее количество для превращения всех остальных нуклеозйдмоно-фосфатов в нуклеозидтрифосфаты.

Синтез дезоксиаденозин-5'-трифосфата (дАТФ) и дезоксигуанозин-5'-три-фосфата (дГТФ) осуществляется посредством реакции восстановления рибозы по гидроксильной группе при втором углеродном атоме. В случае дГТФ реакция восстановления идет на уровне ГДФ с последующим превращением дГДФ в дГТФ:

Восстановление

ГДФ -> ДГДФ;

Дезокситуанилаткиназа

дГДФ+АТФ . -> АДФ+дГТФ

Механизм реакции восстановления остатка рибозы в остаток дезоксирибо-зы в случае пуриновых рибонуклеозиддифосфатов идентичен рассмотренному ранее для пиримидиновых нуклеотидов. Сам же процесс восстановления стимулируется дГТФ и дТТФ, но ингибируется дАТФ.

Как ив случае пиримидиновых нуклеотидов, конечные продукты биосинтеза пуриновых нуклеотидов (ИМФ, АМФ, АДФ, АТФ, ГМФ, ГДФ и ГТФ) угнетают действие амидофосфорибозилтрансферазы—фермента, ускоряющего 1-ю реакцию в цепи процессов, приводящих к новообразованию пуринового

244

кольца. Таким образом, осуществляется саморегуляция образования пуриновых нуклеотидов. Кроме того, при помощи специфического перекрестного участия АТФ и ГТФ в реакциях, ведущих к превращению ИМФ в ГМФ и АМФ соответственно, последние синтезируются в организме всегда в строго определенном соотношения:

АМФ-

АТФ-

ГТФ

Активирование J ¦ИМФ-*-ГМФ

Активирование

Схема эта весьма показательна: она дает представление о принципах саморегуляции, используемых в организме, когда обеспечивается синтез ряда веществ в определенной пропорции по отношению друг к другу. Обеспечение строго определенного соотношения нуклеозидтрифосфатов в организме имеет исключительное значение, так как из них образуются нуклеиновые кислоты. Сходные регуляторные процессы отмечены также в синтезе пиримидиновых нуклеотидов.

Существует еще один путь синтеза пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов в организмах—из свободных пуриновых и пиримидиновых оснований и 5-фосфорибозил-1-пирофосфата. Он не является, конечно, способом синтеза данных нуклеотидов заново, так как при этом используются готовые пуриновые и пиримидиновые циклы, освободившиеся при распаде нуклеиновых кислот; он лишь сберегает пуриновые и пиримидиновые основания от их распада до соответствующих конечных продуктов. Эта реакция ускоряется специфическими ферментами—фосфорибозилтрансфе-разами:

он I

о=р—о—сн, I

он

он он

О—р—О—р—он

он он

5-Фосфорибозил-1- пирофосфат

nh2 n^c-

НС\ Cs. С Аденин-фосфорибозил-Тч-''^!^''' траисфераза

i

Н

Аденин

nh-с

"^с-n

I II I]

oh h%^n-c с* 0=р—о—сн, JO^ + но—р—о

он

?н он

о о

Пирофосфат

ОН ОН Аденозин -51- фосфат

Этот путь, в частности, ярко представлен в злокачественных опухолях.

БИОСИНТЕЗ ДНК И РНК

Выше было показано, что в живой природе осуществляются реакции, обеспечивающие беспрепятственный синтез дезоксирибо- и рибонуклеозид-5'-трифосфатов всех видов: дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ, а также АТФ, ГТФ, ЦТФ и УТФ. Характерно, что новообразование этих соединений регулируется таким образом, что они возникают зависимо друг от друга в строго определенной пропорции. Следовательно, в организме всегда обеспечено существование всех их одновременно в необходимых концентрациях. Именно из нукле-озидтрифосфатов и осуществляется биосинтез нуклеиновых кислот.

Первой характерной чертой специфического биосинтеза нуклеиновых кислот является то, что он протекает только при наличии всех четырех видов дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ) в случае синтеза ДНК или же в присутствии всех четырех видов рибонуклеозидтрифос-фатов (АТФ, ГТФ, ЦТФ и УТФ) в случае синтеза РНК. Вторая—состоит в том, что биосинтез идет при каталитическом воздействии ферментов—ДНК- или РНК-полимераз. Третья весьма своеобразная черта—необходимость для его осуществления затравки в виде уже готового полинуклеотида, который играет роль матрицы. Последнее имеет принципиальное значение, так как именно благодаря этому обеспечивается специфический биосинтез нуклеиновых кислот со строго заданной последовательностью нуклеотидных остатков в молекуле.

Общая схема биосинтеза дезоксирибонуклеиновых кислот может быть представлена в следующем виде:

ядАТФ

+

лдГТФ mj?*; днк-i +

идЦТФ +

идТТФ

(ДНК-нуклеотнпил-трансфераза); ДНК-матрица

ДАМФ

У дГМФ

У дЦМФ

У дТМФ

Пирофосфат

Она была впервые предложена А. Корнбергом (1958) на основании опытов, проведенных с ДНК-полимеразой, выделенной из кишечной палочки. В том же году С. Шпигельман тоже из кишечной палочки получил РНК-полимера