364 аминокислот (в каждом по 2 субдомена) и пространственно организована так, что может охватывать биспиральную молекулу ДНК, расплетая ее за счет энергии распадающейся АТФ.

Этапы биосинтеза ДНК. Исходя из приведенных выше данных о ферментах и белковых факторах, принимающих участие в биосинтезе ДНК, постулирована схема этого процесса. Она базируется на представлении о существовании репликативного комплекса ферментов и белковых факторов, необходимых для осуществления биосинтеза ДНК, локализованных в репликативной вилке, т. е. той зоне ДНК, где происходит распаривание биспирального полидезоксири-бонуклеотида и сборка дочерних, новообразуемых цепей ДНК (рис. 85): В соответствии с этой схемой биосинтез ДНК распадается на 3 этапа: инициацию, элонгацию и терминацию. Следует подчеркнуть, что многие вопросы, касающиеся механизма биосинтеза ДНК, еще не до конца выяснены и рассматриваемая модель является в определенной мере условной.

Инициация биосинтеза ДНК, понимаемая в узком смысле как начало биосинтеза дочерних полидезоксирибонуклеотидньгх цепей на материнских, сводится к созданию на материнской цепи ДНК затравочного олигонуклеотида со свободной гидроксильной группой на З'-конце этого олигонуклеотида. Без него не работает ни одна из ДНК-полимераз. Этот короткий (несколько десятков звеньев) олигорибонуклеотид, заканчивающийся пиримидиновым нуклеозидом, является праймером, т. е. предшественником будущей цепи ДНК, и синтезируется при участии фермента типа РНК-полимеразы, получившего название праймазы (М = 60000, 100 молекул в клетке кишечной палочки). Только после его создания в синтез включается ДНК-полимераза III, при посредстве которой синтезируется далее на материнской цепи ДНК дочерняя цепь ДНК. Впоследствии ковалентно присоединенный к этой новообразованной цепи ДНК фрагмент РНК (праймер) «вырезается» при помощи нуклеаз и одноцепочечная брешь застраивается олигодезоксинуклеотидным фрагментом тоже при посредстве ДНК-полимеразной (репаразной) реакции (рис. 85).

Инициация биосинтеза ДНК, понимаемая в более широком смысле как комплекс процессов, приводящих к старту в биосинтезе ДНК, сводится к возникновению репликативного комплекса ферментов и белковых факторов и формированию репликативной вилки (рис. 85). Она включает присоединение к биспиральной ДНК (к одноцепочечному ее фрагменту в момент распаривания биспиральной структуры в результате флуктуации) ДНК-связывающего белка, ДНК-раскручивающего белка, ДНК-полимеразного комплекса, ДНК-зависимой РНК-полимеразы (праймазы), а также комплекса белковых факторов, называемого праймосомой и обеспечивающего продвижение репликативной вилки (рис. 85), ее пространственную организацию и функционирование.

Элонгация биосинтеза ДНК складывается по меньшей мере из двух процессов: репликации участков материнских цепей ДНК и соединения друг с другом синтезированных при репликации фрагментов новообразуемых цепей ДНК. Первый осуществляется при посредстве ДНК-полимеразной реакции (см. рис. 83), идущей со скоростью (в н. о./с) в среднем около 1000 у бактерий, 100—у животных и 10—у растений. Своеобразие его состоит в том, что репликация идет не непрерывно, а фрагментарно: за один раз у прокариот синтезируется полидезоксирибонуклеотид с коэффициентом седиментации 8— 10S, т.е. молекулярной массой в несколько сотен тысяч дальтон (примерно из 1000 н. о.). У эукариот фрагменты Оказаки короче, около 200 н. о., что сопоставимо с длиной нуклеосомной ДНК, в чем, по-видимому, есть определенный

253

' Дмймя спираль родтлмвов ДНК

Ведущая цепь роджтельсхоа ДНК.

ДНК-связываюгцнЯ белок

, Комплекс, включающий хеликазу, праиыосому ¦ праймазу

• Праймер

Ведомая цепь Предательской ДНК

смысл. Эти фрагменты получили название фрагментов Оказаки в честь японского биохимика, впервые в 1967 г. на VII Международном биохимическом конгрессе в Токио предложившего схему биосинтеза ДНК, в которой были преодолены трудности, связанные с антипараллельностью цепей ДНК в ее биспиральной молекуле. Дело в том, что ДНК-полимеразы способны наращивать полинуклео-тидную цепь в направлении только 5'->3', т. е. путем переноса нуклеотидного остатка с дезоксирибонуклеозидтрифосфата на гидроксильную группу З'-угле-родного атома растущей полидезоксирибонуклеотидной цепи. Но так как цепи материнской ДНК антипараллельны, т. е. направление чередования нуклеотидных звеньев в них противоположно (см. рис. 85), то один и тот же фермент, т. е. ДНК-полимераза, не может обеспечить сборку дочерних цепей одновременно в направлениях 5'->3' и 3'-+5' в соответствии с перемещением репликационной вилки при расплетании биспиральной молекулы ДНК. Т. Оказаки предположил, что ДНК-полимераза ведет синтез ДНК челночным способом: сначала передвигаясь вперед в направлении 5'-+3' по одной цепи, а затем в том же направлении 5'-*3', но передвигаясь в обратную сторону по другой цепи. Те фрагменты Оказаки, у которых олигорибонуклеотидные праймеры заменены при участии ДНК-полимеразы I на дезоксирибонуклеотидные фрагменты, при посредстве ДНК-лигазы объединяются вместе (см. рис. 84 и 85) и дают начало дочерней цепи ДНК. Есть и другой взгляд на механизм преодоления антипараллельности цепей ДНК; суть его ясна из рассмотрения рис. 85, Б и легенды к нему.

Вопрос, синтезируются ли на одной из цепей родительской ДНК фрагменты Оказаки, т. е. идет ли на ней прерывистый биосинтез цепи дочерней ДНК, а на другой—непрерывный биосинтез цепи дочерней ДНК, остается дискуссионным. Видимо, как правило, происходит прерывистый синтез на обеих цепях родительской ДНК, а сочетание прерывистого и непрерывного является исключением, вполне доказанным для репликации некоторых фаговых ДНК. Решение проблемы одно- или двунаправленной репликации однозначно: от точки инициации репликационные вилки распространяются по биспиральной молекуле ДНК в двух противоположных направлениях.

По поводу терминации биосинтеза ДНК мнения разноречивы. Предполагают, что прекращение репликации ДНК программируется особой нуклеотид-ной последовательностью, в том числе в виде специальных палиндромов («кроличьих ушей») на конце хромосомы. Само собой разумеется, что репликация прекращается, когда встречаются две репликационные вилки при удвоении как кольцевых, так и линейных ДНК. Наконец, возможно достраивание ведомой цепи за счет праймирования З'-конца материнской цепи с участием специфического белка, находящегося на ее конце.

Точность репликации ДНК весьма велика—одна ошибка на 1010 нукле-отидилтрансферазных реакций. Но даже если ошибка допущена, она может быть исправлена в ходе репарационных процессов.

Биосинтез ДНК на РНК в качестве матрицы. Кроме рассмотренного выше механизма биосинтеза ДНК на полидезоксирибонуклеотидной матрице в последние годы открыта система биосинтеза ДНК на РНК при посредстве

Рис. 85. Схема биосинтеза фаговой ДНК в клетке кишечной палочки:

А—плоскостная модель, согласно которой синтезу затравочного олигорибонуклеотида (праймера) под действием ДНК-заяиси-моя РНК-полимеразы (праймазы) способствует белковый комплекс, называемый праймосомой (л—25 кДа, л*—73 кД», я*— 11 кДа, /—80 кДа, dnaB—300 кДа, dnaC—29 кДа), движущийся в направлении» противоположном элонгации, н создающий Новые центры синтеза праймера- Раскручивание биспиральной ДНК на одноцепочечные полндеэоксирибоиуглеотнды осуществляется хеликазой (от англ. helix—спираль), а релаксация суперспиральной ДНК—гиразой (от англ. gyration—кругловрвшательноа движение). Б—пространственная модель, демонстрирующая преодоление антипараллельности цепей ДНК за счет возникновения петли ДНК, где чередование фосфоридиэфирных связей на ее восходящем отрезке изменяется на обратное и не препятствует ДНК-полимеразе вести синтез фрагмента Оказаки на ведомой цепи родительской ДНК в том же направлении, что и на ведущей

цепи. Остальные пояснения в тексте

255

фермента, названного обратной транскриптазой или ревертазой (его называют также РНК-зависимой ДНК-полимеразой). Этот фермент был обнаружен в 1970 г. независимо друг от друга Д. Балтимором в составе вируса Раушера лейкемии мышей и Г. Теминым и С. Мизутани в составе вируса саркомы Рауса. Ревертаза активируется Мп2+ сильнее, чем Mg2+, и содержит Zn . Синтезированная ДНК имеет небольшую молекулярную массу и характеризуется константами седиментации от 2S до 7S. Как и обычные ДНК-зависимые ДНК-полимеразы, ревертаза нуждается в праймере, роль которого может играть тРНК, в чем проявляется регулирующая роль последней в обмене веществ. Ее молекулярная масса колеблется от 70 до 180 к Да в зависимости от объекта, из которого она выделена; фермент, как правило, состоит из двух субъединиц.

Значение открытия ревертазы состоит прежде всего в том, что выявлен дополнительный механизм биосинтеза ДНК, который, как предполагают, может использоваться для амплификации генов. Исследование ревертазной реакции крайне существенно для изучения перерождения нормальной клетки в раковую. Ревертаза нашла применение в молекулярной биологии для синтеза генов и фрагментов генов и, как следствие этого, в генетической инженерии. Новой областью ее использования является массовая расшифровка через кДНК первичной структуры РНК и белков.

Учитывая исключительную важность работ по исследованию обратной транскрипции, в нашей стране начиная с 1972 г. осуществляют проект «Ревертаза», в разработке которого принимали участие академии наук СССР и стран СЭВ. В результате проведенных исследований удалось создать универсальную систему обратной транскрипции, позволяющую вести синтез ДНК с любой заданной точки в молекуле РНК при помощи синтетического праймера (ок-тадезоксирибонуклеотид заданного строения), комплементарного межгенной зоне одной из фаговых РНК. Кроме того, путем ревертазной реакции получена ДНК на глобиновой мРНК голубя и гигантских ядерных РНК. Действием ревертазы in vivo в ДНК введена онкогенная информация, успешно изучается структура РНК-содержащих опухолеродных вирусов, синтезированы потенциальные ингибиторы ревертазы.

Продолжаются интенсивные работы по изучению свойств ревертаз, выделенных из различных опухолеродных вирусов (в том числе человека), синтезу ингибиторов ревертаз, не действующих на клеточные ДНК-полимеразы, получению ДНК-транскриптов для работ по генетической инженерии, исследованию интеграции ДНК, синтезированной на вирусной РНК, в геном клетки.

За этот цикл работ группе советских исследователей и ученых стран СЭВ в 1979 г. присуждена Государственная премия СССР. Начиная с 1980 г. проект «Ревертаза» преобразован в проект «Ревертаза-онкоген».

Биосинтез РНК. Биосинтез РНК осуществляется на ДНК в качестве матрицы. С точки зрения передачи информации в живых системах он характеризуется как процесс транскрипции, т.е. переписывания информации, содержащейся в последовательности нуклеотидных остатков в ДНК-матрице, в последовательность нуклеотидных звеньев в молекуле новообразуемой РНК. Та часть молекулы ДНК, которая копируется в процессе биосинтеза РНК на ней, носит название транскриптона. Последний содержит информативную и неинформативную зоны. Транскрибирование информативной зоны приводит к образованию той части новообразуемой РНК, которая впоследствии дает начало РНК с определенной функциональной активностью. При копировании неинформативной зоны продуцируется та часть насцентной РНК, которая впоследствии, в процессе созревания вновь синтезированной РНК, разрушается. Соотношение информативной и неинформативной частей в транскриптонах прокариот и эукариот резко различно и составляет в среднем 9:1 и 1:9 соответственно.

256

Неинформативная зона транскриптона содержит регуляторные последовательности, с которыми взаимодействуют многочисленные (их открыто несколько десятков) регуляторные белковые факторы, ускоряющие или замедляющие процесс транскрипции. Они контактируют с определенными последовательностями нуклеотидных остатков в ДНК присущими им ДНК-связывающими доменами. Так, например, транскрипционный фактор ША из ооцитов шпорцевой лягушки содержит РР'ос—надвторичную структуру с атомом Zn в ее составе (см. рис. 41), так называемый цинковый палец, обеспечивающий прикрепление к ДНК.

У эукариот основная масса РНК синтезируется в ядре клетки, где локализация биосинтеза различных видов РНК также различается (рис. 86).

Биосинтез РНК осуществляется при посредстве РНК-полимераз, которые в основном являются ДНК-зависимыми и лишь в некоторых случаях РНК-зависимыми ферментами. Механизм их действия во многом совпадает с тако-

Рис. 86. Локализация биосинтеза различных видов РНК в ядре клетки

Все виды РНК синтезируются на ядерной ДНК в качестве матрицы. В ядрышке сосредоточена рДНК, являющаяся матрицей в биосинтезе предшественников рибосомальных нуклеиновых кислот (45S РНК), при созревании которых возникают 18S и 28S рРНК (короткими стрелками подчеркивается многоступенчатость процесса превращения предшественников в функциональные РНК). рДНК в определенные периоды клеточного цикла многократно реплицируется, что обеспечивает наработку большего количества рДНК (на рисунке это отмечено трехкратным повторением зоны рДНК в ядрышке). Все новообразованные РНК выходят в виде нуклео-протеинов через поры ядерной мембраны, в цитоплазму, где рРНК используется для образования 40S и 60S субчастиц рибосом, а мРНК, SS рРНК в тРНК—при превращении неактивных рибосом в активные, транслирующие рибосомы

РДНК

днк-

5sphk

2юрнк

Ядрышко

тРНК

ZZZZZZZ. -?Ё~мРНК

шг

Транслирующая рибосома

> Ядро

Ядерная мембрана

»Цитоплазма

вым у ДНК-полимераз: они ускоряют биосинтез РНК из АТФ, ГТФ, ЦТФ и УТФ тоже путем нуклеотидилтрансферазной реакции. Обеспечение уникальной первичной структуры новообразуемой РНК происходит за счет спаривания соответствующего рибонуклеозидтрифосфата с комплементарным ему нуклеотадным остатком матричного полинуклеотида в точке роста молекулы РНК. Но есть существенные различия: РНК-полимеразы не нуждаются в прай-мере, обладают способностью избирательно взаимодействовать с зоной промотора ДНК (точка, с которой начинается биосинтез РНК), являются сложными молекулами, построенными из нескольких еубъединиц, и др.

Наиболее изучены РНК-полимеразы прокариот, в частности кишечной палочки. РНК-полимераза кишечной палочки, представленная белком с М=487 ООО, состоит из пяти субъединиц: двух а, одной р, одной р' и одной а. Форма еубъединиц, их молекулярные массы и вероятный вариант компоновки показаны на рис. 46.

В целом же у прокариот (изучено несколько десятков видов) молекулярные массы РНК-полимераз колеблются в довольно широких пределах (а: 36—45 кДа, р: 86—160 кДа, р': 96—175 кДа и а-фактор: 44—107 кДа). Прокари-отические РНК-полимеразы синтезируют все виды РНК—рибосомальные, матричные, транспортные и низкомолекулярные. В отличие от них эукари-отические РНК-полимеразы типа I (М=473 кДа, 6 субъединиц) транскрибируют гены рРНК; типа II (М = 882 кДа, 10 ±2 субъедишщы)—гены, кодирующие

9—3502

257

белки; типа III—гены малых стабильных РНК (тРНК, 5S рРНК) (М ~653 к Да, 9 субъединиц). Каждая из субъединиц РНК-полимераз выполняет свою функцию: одни из них узнают нуклеотидную последовательн