ишь грубую схему тех тонких процессов, которые происходят во время карбоксилирования рибу-лозо-1,5-дифосфата в активном центре специфического фермента, ускоряющего многостадийные преобразования при акцептировании СОг- Этот самый распространенный на Земле фермент называют рибулозодифосфаткарбоксила-зой (РДФК). Его систематическое название—З-фосфо-Ъ-глицерат карбокси-лиаза димеризующая. К настоящему времени он выделен из нескольких десятков объектов (высшие растения, зеленые водоросли, сине-зеленые водоросли, фототрофные и хемоавтотрофные бактерии). При молекулярной массе в 500 ООО—600 000 он обладает четвертичной структурой (8 больших субъединиц с М = 50000—60000 и 8 малых с М = 12000—15000), которая изучена методами рентгеноструктурного анализа и электронной микроскопии (рис. 119). Большие субъединицы являются каталитическими и несут центры связывания рибулозо-1,5-дифосфата и СОг, а малые—регуляторными и имеют ряд аллостерических центров для соединения с эффекторами (Mg2+, фрук-тозо-6-фосфат, HS—содержащие соединения и др.). Субъединицы РДФК син-

360

, op,

ф

Рис. 119. Структура рибулозодифосфаткарбоксилазы:

четвертичная—высших растений (а) и водородных бактерий (6—вид сбоку, в—вид сверху), изученная злектронно-микроскопически, третичная—малой субъединицы высших растений, изученная методом рентген ос тру к тур но г о анализа (г). Остальные пояснения—в тексте

хронно синтезируются: большие—на рибосомах 70S в хлоропластах, малые—на рибосомах 80S в цитоплазме, спонтанно собираясь в нативный мультимер.

В значительной мере выяснены структура и работа активного центра РДФК; предполагают, что рибулозо-1,5-дифосфат связывается в нем за счет взаимодействия фосфатных групп с радикалами лизина, енолизация субстрата идет при участии HS-групп (их насчитывается 96), акцептирование СОг по енодиольной группе сопровождается переносом протонов при помощи гистидиновых остатков. РДФК активируется светом при помощи светочувствительного белкового фактора (М=4000—8000) и ингибируется молекулярным кислородом, инициирующим оксигеназную (см. гл. X) функцию (т. е. окисление рибулозо-1,5-дифосфата в 3-фосфоглицериновую кислоту и 2-фосфогликолевую кислоту) этого уникального фермента, обеспечивающего фиксацию СОг и первичный биосинтез углеводов в космических масштабах.

Как отмечено выше, центральную роль в осуществлении фотосинтеза играет трансформация энергии света в разность потенциалов мембраны фотосинтетического центра и сопряженный с этим синтез АТФ. Недавно, используя методы спектроскопии, рентгеноструктурного анализа и молекулярной генетики, удалось получить детальную картину событий, происходящих при фотосинтезе и выявить пространственное расположение и роль белков и пигментов, участвующих в этом процессе. За эту работу немецкие ученые Р. Хубер, И. Дайзенхофер и X. Михель удостоены Нобелевской премии 1988 г.

Возникшая в результате рассмотренных выше процессов фосфоглицерино-вая кислота восстанавливается в 3-фосфоглицериновый альдегид:

ОН

сн,—о—1>=о он

2CHOH

Чэн

З-Фосфоглицерм-новая кислота

ОН

I

сн,—О—Р=0

¦ I он

+ 2НАДФН + 2Н* s* 2СНОН + 2НАДФ+ + 2Н,0

.О

\н

З-Фосфоглицернно-вый альдегид

Данная реакция тоже идет более сложным путем, нежели показано в приведенном выше уравнении. Она представляет собой обращение процесса перехода 3-фосфоглицеринового альдегида в 3-фосфоглицериновую кислоту,

361

осуществляющееся при дихотомическом распаде глюкозы. Напомним, что указанный процесс ускоряется глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой и идет через 1,3-дифосфоглицериновую кислоту с тем лишь отличием, что содержащаяся в хлоропластах форма этого фермента специфична в большей степени к НАДФН, чем к НАДН, отличается очень высокой молекулярной массой (600 ООО) и специально приспособлена для восстановления фосфоглицериновой кислоты в фосфоглицериновый альдегид. Это значит, что при восстановлении 3-фосфоглицериновой кислоты в З-фосфоглицериновый альдегид будет расходоваться АТФ (см. уравнение реакции на схеме 5, с. 344). |

Следовательно, на этой стадии биосинтеза углеводов снова используется АТФ, образовавшаяся при фотосинтетическом или хемосинтетиче-ском фосфорилировании и энергетически обеспечивающая новообразование углеводов. Здесь же, как следует из приведенного выше уравнения реакции восстановления 3-фосфоглицериновой кислоты, осуществляется в сущности восстановление акцептированного СОг при посредстве НАДФН, возникшего одновременно с АТФ на первой фазе фотосинтетического процесса.

Дальнейший путь синтеза углеводов из 3-фосфоглицеринового альдегида, так же как и только что рассмотренная реакция восстановления 3-фосфоглицериновой кислоты, представляет обращение дихотомического пути распада углеводов: фосфоглицериновый альдегид переходит в фосфодиоксиацетон; при каталитическом воздействии альдолазы из упомянутых фосфотриоз синтезируется фруктозо-1,6-дифосфат, переходящий далее в глюкозо-6-фосфат. На этом этапе биосинтеза углеводов действует особый фермент—фруктозо-1,6-дифосфатаза (молекулярная масса фермента из растений и фото- и хемосинтезирующих организмов—130000—190000; две субъединицы; отличается абсолютной специфичностью), обеспечивающая переход от фруктозо-1,6-дифос-фата к фруктозо-6-фосфату, так как реакция:

фруктозо-6-фосфат+АТФ=фруктозо-1,6-дифосфат+АДФ практически необратима. Фруктозо-6-фосфат, как известно, легко превращается в фосфорные эфиры других моносахаридов, что в итоге обеспечивает синтез всего набора природных моноз, а из них—дисахаридов и полисахаридов. Ход реакции первичного новообразования углеводов в процессе фотосинтеза дан на схеме 9.

Что касается синтеза простых углеводов организмами-гетеротрофами, то исходными веществами для этого могут служить продукты распада липидов, белков и других органических соединений. Центральным звеном в переходе этих соединений в простые (а далее и сложные) углеводы является образование ПВК, возникающей или непосредственно (например, при распаде аминокислот), или при посредстве глиоксилового цикла—при декарбоксилировании щавелевоуксусной кислоты (см. с. 395). Переход от ПВК к углеводам осуществляется путем обращения процесса дихотомического распада углеводов, следовательно, из каждых двух молекул ПВК образуется одна молекула фруктозо-1,6-дифосфата. Однако здесь есть одна особенность: переход от ПВК к фос-фоенолпировиноградной кислоте идет обходным путем через щавелевоуксусную кислоту вследствие необратимости реакций превращения фосфоенолпирувата в ПВК. Так эта реакция протекает в печени, почках и других тканях животных, в листьях и корнях растений и у микроорганизмов. Только в мышцах действие пируваткиназы обратимо, и фосфоенолпировиног-радная кислота возникает из ПВК и АТФ.

Кроме рибулозо-1,5-дифосфатного пути, существует еще два механизма акцептирования СОг, занимающих подчиненное положение по отношению к первому.

362

АДФ + Н3Р04 2НАДФ++2Н20

Свет

-АТФ

Хлорофилл

•С?

*—"-2 НАДФН +2Н++ 02

СН2ОН

СО АТФ АДФ

н—с—он —4 * »

| Фосфорибуло

Н-С-ОН

СН,—О

i 2 СО

i

H-C—ОН i

Г —Р=С

он

со,

он

сн„—о—р=о 2 i

он

Рибулозо-5-фосфат

киназа Н—С—ОН i

РДФК

ОН I

СИ,—О—Р=0 ОН

Рибулозо-1,5-дифосфат

СН

ОН

О— Р=0 ОН

- 2 HCOH

соон

3 -Фосфог лицериио-аая кислота

ОН ОН СНя—О—р=о СНя— О—Р=0

' он— .....1

+ .

2 HCOH ОН + 2 НАДФН+2Н^*г2НСОН ОН + 2 НАДФ +2 HjO

СООН Глицеральде-С^^ З-Фосфоглицери - гид-3-<росфат- з_ф0сфОГЛицерииовый

новая кислота дегидрогенааа альдегид

ОН ' Триозо- он

Т ыросфат- i

СН,—О—Р=0 изомераза СН,—О—Р=0

i i * | i

НСОН он -*-СО он

сс?° <1няон

З-Фосфоглицерииовый Фосфедиокси-альдегид ацетои

I_

""^Альдолаза Ф рукто зо -1,6 - ди фосфат

т

Углеводы

Схема 9. Механизм биосинтеза углеводов в растениях Один из них состоит в карбокенлированни фосфоенолпировиноградной

кислоты:

соон I

сн2

сн2 он

Д л J. ~__ „ Фосфоенолпяруват-

с—0~ Р=0+С02+Н20—г-—• I

| | карбоксилаза CO + H3PO4

СООН ОН |

СООН

Фосфоенол- Щавелевоуксусная пяруват кислота

Фермент, ускоряющий эту реакцию, выделен из растений (обладающих С4-типом фотосинтеза), хемосинтезирующих и гетеротрофных бактерий (М« 400000; четыре субъединицы).

363

Другой механизм акцептирования СОг сводится к карбоксилированию аци-льных производных коэнзима А (ацетил-КоА, пропионил КоА, сукцинил-КоА). Например:

лл *-г ч Пируватсивтаза

СНз—СО "v КоА+СОг+Ферредоксин (восст.) ¦

—СН3 - СО - СООН+HSKoA+Ферредоксин (окисл.)

Донорами атомов Н в указанных реакциях служат ферредоксины—железосодержащие белки негеминовой природы с М«6000 у бактерий и около 17000 в хлоропластах. Они содержат несколько атомов Fe, собранных в кластер и присоединенных, с одной стороны, к радикалам цистеина белковой части, а с другой—связанных с атомами лабильной серы.

Продукты, возникающие по фосфоенолпируват- и ацилкоэнзим-А-кар-боксилазному механизму (пировиноградная, а-кетоглутаровая и щавелевоук-сусная кислоты), используются для биосинтеза структурных элементов белков, углеводов, нуклеиновых кислот и липидов или обмениваются далее в цикле трикарбоновых и дикарбоновых кислот, усиливая, таким образом, метаболические возможности организма. Это послужило основанием для создания препарата-карбостимулина (NaHC03—25 г, MgS04-7H20—3 г, MnS04-7H20—0,05 г, ZnS04-7H20—0,05 г, цитрат натрия—7 г), находящего благодаря работам школы акад." М. Ф. Гулого все более широкое применение для повышения продуктивности животных, в медицинской практике и т. п.

Синтез олигосахаридов. Долгое время предпринимались безуспешные попытки доказать, что синтез олигосахаридов, в частности дисахари-дов, представляет собой реакцию обращения их гидролиза. Однако, несмотря на многочисленные эксперименты такого рода, никто не сумел подобрать условия, при которых удалось бы направить вспять реакцию гидролиза, например сахарозы, протекающую при участии р-фруктофуранози-дазы (сахараза).

Оказалось, что биосинтез олигосахаридов осуществляется путем реакций трансгликозилирования. Перенос гликозильного остатка на один моносахарид идет с фосфорного эфира другого моносахарида и ускоряется специфической гликозилтрансферазой.

Исходными соединениями, с которых в процессе синтеза олигосахаридов гликозильный остаток энергично переносится на моносахарид, служат нукле-озиддифосфатсахара (НДФ-сахара).

Они были открыты Л. Лелуаром с сотр. (1950) и очень быстро привлекли к себе внимание как наиболее вероятные метаболиты в биосинтезе углеводов. В настоящее время известно свыше 50 представителей НДФ-сахаров.

Ясна и причина их особого значения в качестве доноров гликозильных остатков: при гидролизе НДФ-сахаров изменение уровня свободной энергии значительно выше, чем при гидролизе других доноров, а нуклеотидная часть их молекул способна обеспечить избирательность гликозилтрансферазной реакции.

В случае синтеза сахарозы, например, специфический фермент—сахарозо-синтаза, ускоряет реакцию переноса остатка глюкозы с уридиндифосфат-глюкозы на фруктозу (см. с. 365).

Долгое время считали, что именно так синтезируется сахароза в растениях (животные не синтезируют сахарозу, а лишь используют ее). Однако оказа-

364

ОН ОН

У риди н дифосф ат глюкоз а (УДФ-глюкоза)

Сахароэосинтаза qj. qj. (М-405000; 4X96000) 1 1 ° ->- НО—р—О—р—О—СН2 Г\

(УДФ-глюкоза:0-фрук- Д Д тоза 2-глюкозилтравс фераза)

HjOH

[/Г °\Н НОСНо/Х. н

SS1 hl/1 + \он н/ но) . ">|—f н hoNU^^o-IY^c

он он

УДФ (уридинлифосфат)

' '—и—' ^ажажваГ СН2ОН ОН ОН Н

Сахароза

лось, что эта реакция ввиду ее обратимости служит для поддержания равновесия между сахарозой и УДФ-глюкозой и даже используется для наработки УДФ-глюкозы во время ее энергичного использования для биосинтеза крахмала и гликогена (см. следующий раздел этой главы). Этот процесс, в частности, идет в больших масштабах в клубнях растений, запасающих крахмал. Сахароза же в действительности синтезируется при помощи гликозилтранс-феразной реакции из УДФ-глюкозы и фруктозо-6-фосфата:

ЩФ-глмоза+Фруктозо-В-Р Сахарозофосфат-сиитаза^ (УДФ-глюкоза: ц-фруктозо-6-фосфат -2-а-глюкошл-трансфераза)

-УДФ+Сахарозо-6-фосфат

Фосфатаза

Сахароза

н,ро4

Как видно из уравнения реакции, сахарозофосфат-синтаза (молекулярная масса фермента из проростков пшеницы—380000) действует в паре с фосфа-тазой, которая обеспечивает молниеносное отщепление остатка фосфорной кислоты от сахарозо-6-фосфата, чем полностью сдвигает реакцию вправо. Этот процесс идет в листьях растений, и образовавшаяся сахароза оттекает из них в клубни и корни. Аналогично синтезируется главный дисахарид насекомых, высших и низших грибов и микобактерий—трегалоза.

Будучи широко распространены в природе, НДФ-сахара синтезируются из фосфорных эфиров моносахаридов и соответствующих нуклеозидтрифосфа-тов путем нуклеотидилтрансферазных реакций, например:

365

а-0-Маннозо-1- Гуанозин- Пирофосфат Гуаноэиндифосфатманноза фосфат трифосфат

Известно более двух десятков нуклеотидилтрансфераз, ускоряющих реак- • цию переноса тех или иных нуклеотидных остатков на соответствующие фосфорные эфиры моносахаридов с освобождением пирофосфата. Наряду с фосфорными эфирами моносахаридов и нуклеозиддифосфатсахарами роль доноров гликозильных остатков в реакциях биосинтеза олигосахаридов могут выполнять сами олигосахариды, а также декстрины.

Из сказанного выше ясно, что биосинтез олигосахаридов идет путем переноса гликозильных остатков на моносахариды с разнообразных субстратов при участии в каждом конкретном случае соответствующих гликозилтранс-фераз. При этом новообразование химических связей сопряжено с распадом их в тех соединениях, с которых идет перенос гликозильных остатков.

Синтез полисахаридов. Подобно синтезу олигосахаридов новообразование полисахаридов также идет путем трансгликозилирования. Полная аналогия существует и в характере субстратов, с которых переносятся гликозиль-ные остатки на конец растущей цепи полисахарида. Ими могут быть фосфорные эфиры моноз, НДФ-сахара и олигосахариды- Реакции переноса остатков моносахаридов в процессе биосинтеза полисахаридов ускоряются соответствующими гликозилтрансферазами. Приведем несколько примеров.

Синтез амилозы, целлюлозы и подобных им 1,4-глюканов может происходить путем переноса гликозильных остатков с глюкозо-1-фосфата или аналогичных фосфорных эфиров моносахаридов. Эта реакция представляет собой обращение реакции фосфоролиза указанных соединений (см. с. 333). Однако более существенное значение имеет другой путь: биосинтез из НДФ-сахаров при участии соответствующих трансгликозидаз. Это уравнение реакции наращивания молекулы а-1,4-глюкана на один остаток глюкозы представлено на с. 367.

Как следует из приведенного уравнения реакции, перенос гликозильного остатка идет на невосстанавливающий конец молекулы синтезируемого полисахарида. Эта реакция может повторяться многократно, что обеспечивает ступенчатый синтез молекул полисахаридов, содержащих огромное число остатков моносахаридов. Характерная особенность реакций такого типа состоит в необходимости затравки, т. е. наличия в