>30

декстрана, в результате чего между молекулами последнего возникает то или иное число поперечных связей:

В цепь

К 3-му углеродному атому остатка глюкозы соседней цепи декстрана

Аналогично этому обработка другого полисахарида—агарозы 2,3-ди-бром-пропанолом в резко щелочных условиях приводит к возникновению сетчатого полимера сефарозы, дающего гели, пригодные для фракционирования белков с молекулярными массами в сотни тысяч дальтон.

В зависимости от числа поперечных связей в сефадексе и размера белковых молекул осуществляется та или иная степень проникновения последних внутрь гранул сефадекса, заполняющих колонку. Большие белковые молекулы, не способные пройти через сито из ячеек в гранулу, быстро выносятся из колонки с током элюента; мелкие молекулы белка, проникшие внутрь зерна сефадекса, удерживаются некоторое время последним и выходят из колонки с последующими порциями элюата. Таким образом, колонка с сефадексом как бы просеивает через себя молекулы белка по их размерам, выпуская, как это ни парадоксально, первыми самые крупные молекулы (рис. 11). Так как гранулы сефадекса сильно разбухают в растворителе и образуют гель, этот метод называют также методом гельфильтрации.

Интересен предложенный П. А. АльбертсоНом метод фракционирования белков с помощью двухфазных систем, составленных из водных растворов полимеров. При этом способе фракционирование осуществляется в мягких условиях (физиологические значения ионной силы и рН среды), а водные растворы полимеров оказывают стабилизирующее действие на разделяемые белки. Метод позволяет работать с любыми количествами вещества,

аналогичные сефадексу материалы—молселект (сефадекс фирмы «Реанал», Венгрия), акрилекс и биогель Р (на базе полиакриламида), сефакрил (получают из аллилдекстрана и N, N'-метилен-бисакриламида), сефарозу (получают из агарозы) и др. Перечисленные материалы нашли широкое применение не только для фракционирования белков, но и для разделения нуклеиновых кислот, высших углеводов и других биополимеров (см. также с. 32S).

31

А—колонка в начале работы: светлые кружки—зерна сефадекса: темные точки—молекулы белков разной молекулярной массы, только что внесенные в верхнюю часть колонки; Б—по мере продвижения проявителя по колонке (сверху вниз) осуществляется перенос молекул белков, однако только меньшие молекулы белков проникают внутрь зерен сефадекса; В—мелкие молекулы белков резко отстают от крупных его молекул, задерживаясь в зернах сефадекса. Первыми из

Рис. 11. Механизм разделения веществ по молекулярной массе на колонке с сефадексом:

колонки выйдут большие молекулы

л

б в

используя простейшую аппаратуру. Распределение белков между фазами определяется различиями в физико-химических свойствах фракционируемых белков и полимеров, входящих в состав верхней и нижней фаз: на основе комплекса свойств тех и других происходят взаимодействия (образование ионных и водородных связей, гидрофобные взаимодействия и др.), приводящие к накоплению определенного белка или группы белков в одной из полимерных фаз.

Белки, выделенные описанными способами, всегда содержат некоторое количество низкомолекулярных примесей, особенно ионов солей. Для полного освобождения от этих примесей белки подвергают дальнейшей очистке путем диализа, электродиализа, ультрафильтрации и перекристаллизации, гельфиль-трации и другими способами.

Очистка белков методом диализа состоит в длительном, в течение нескольких суток, пропускании воды через сосуд, в который погружен диализацион-ный мешочек. Его готовят из материалов, хорошо проницаемых для низкомолекулярных соединений и ионов, но не пропускающих крупных молекул белка. Материалом для полупроницаемых мембран служит целлофан, размер пор которого можно изменять в широких пределах обработкой раствором ZnCI2. Внутрь диализационного мешочка (камеры) помещают раствор белка. Камеру, как правило, снабжают капиллярной трубкой. В нее в первые часы диализа устремляется часть белкового раствора, объем которого возрастает вследствие поступления воды внутрь камеры (рис. 12.7).

Даже после длительной очистки белка путем диализа в нем остается некоторое количество ионов, сорбированных, белковыми частицами. Для полного удаления загрязняющих белок ионов используют метод электродиализа: возле полупроницаемых мембран диализационной камеры поме-

ОЧИСТКА БЕЛКОВ

/—трубка для подведения воды; 2—корпус диализатора; 3—диализа ционный' мешочек; 4—трубка для отвода воды и регулирования ее уровня; 5—капиллярная трубка; А—диализа-цнонная камера; Б—корпус электродиализатора; а и а — полупроницаемые мембраны; 6 и бх—электроды стрелками указано направ-

Рис 12. Установки для очистки белка путем диализа (/) и электродиализа (II):

ление движения воды

32

544707

щают электроды, на которые подают напряжение, в результате чего остатки ионов поступают в омывающую мембраны воду и выносятся из аппарата (рис. 12.//).

Полупроницаемые мембраны высокой прочности из нецеллюлозных материалов с калиброванными порами, через которые проходят низкомолекулярные вещества^ но не проникают высокомолекулярные белки, используют для очистки белков методом ультрафильтрации. Белковый раствор продавливают через такую мембрану сжатым газом или центробежной силой. Белок, остающийся в процессе ультрафильтрации на мембране, не только очищается от низкомолекулярных соединений и ионов, но и концентрируется. Если подобрать такой размер пор в мембране, что через них будут проходить не очень крупные белки, а большие белковые молекулы будут задерживаться, то ультрафильтрация может служить для фракционирования'белков. '

Долгое время считали, что белковые вещества существуют только в аморфном состоянии. Однако в 1906 г. наш соотечественник А. Д. Розенфельд впервые закристаллизовал оксидазу, выделенную из редьки, а в 1926 г. американский ученый Д. Самнер получил другой кристаллический белок—фермент уреазу (от лат. urea—мочевина). Затем в течение последующих лет были получены в кристаллическом состоянии десятКи белков.

В настоящее время доказано, что любой белок может существовать в кристаллической форме. В основе различных приемов кристаллизации белка лежит принцип очень медленного приближения к той критической точке, в которой белок из растворенного состояния переходит в осадок. В этом случае белковые молекулы успевают закономерным путем объединиться в надмолекулярные агрегаты и дают кристаллические структуры. Практически такое медленное осаждение белков достигается путем введения соли через полупроницаемую мембрану или при медленном испарении воды из содержащего соль белкового раствора вплоть до точки высаливания. В последнее время получила распространение кристаллизация белков с использованием органических соединений: 2-метил-2,4-пентадиола и полиэтилен-гликоля; с их помощью удалось закристаллизовать ряд белков, не поддававшихся этому традиционными методами.

Несколько видов белковых кристаллов приведено на рис. 13. Кристаллические белки,, особенно полученные в результате перекристаллизации, отличаются высокой степенью чистоты.

Хорошие результаты дает очистка белков от низкомолекулярных примесей при помощи гельфильтрации. Зерна сефадекса достаточно долго удерживают низкомолекулярные вещества, и белковая фракция успевает за это время выйти из колонки в чистом виде. Фильтрацию через гель сефадекса ши- в г

роко используют ДЛЯ обессоли- р^. 13 Виды белковых кристаллов: химотрипсина (А), вания белковых растворов. пепсина (?), белка дрожжей (В), рибонуклеазы (/)

2—3502

33

23456Т89

Взято белка, для растворения, г

10

Рис. 14. Оценка гомогенности белка по независимости растворимости от количества твердой фазы:

сплошной линией показан ход кривой в случае гомогенного белка, пунктиром—при наличии примеси

ОЦЕНКА ГОМОГЕННОСТИ БЕЛКА

Вопрос о том, является ли полученный белковый препарат индивидуальным белком или смесью белков, имеет важнейшее значение. Так как белки выделяют из биологических объектов, содержащих тысячи и десятки тысяч индивидуальных белков (экспериментально в клетках эукариот доказано наличие более 1200 отдельных белков, но теоретически их число приближается к 10000), всегда можно ожидать, что в составе изолированного белка есть примесь других белков; это может привести к неправильным заключениям и выводам о свойствах исследуемого белка. Поэтому в белковой химии большое внимание уделяют оценке гомогенности, т. е. однородности белков. Для этого предложено почти полтора десятка методов. Белок признают гомогенным, если увеличение его количества в твердой фазе не сопровождается возрастанием содержания белка в растворе (рис. 14). Наличие одной белковой полосы при электрофорезе в полиакрила-мидном геле, одного пика на выходной кривой (либо одной белковой зоны на пластинке) при хроматографировании или гельфильтрации, резкой границы пограничного слоя белок—растворитель при ультрацентрифугировании белка являются наиболее надежными показателями гомогенности белкового препарата. В большинстве случаев гомогенны кристаллические белки. Если кривая распределения белковых частиц по высоте при использовании метода свободной диффузии подчиняется теоретической кривой распределения Гаусса, белок гомогенен. Достижение в процессе очистки белка стабильного содержания свободных HS-гругш или содержания радиоактивной метки (при работе с меченым белком), равно как и постоянного уровня биологической (ферментативной, гормональной и т. п.) активности, свидетельствует в пользу гомогенности белка. Выявление единственной N-концевой и единственной С-кон-цевой аминокислоты при анализе белкового препарата также является признаком гомогенности выделенного белка.

Работами последних лет доказано, что каждый индивидуальный белок состоит из молекул только одного вида, строго одинаковой молекулярной массы, состава и строения. Поэтому столь важно получить гомогенный препарат белка.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ МАССА БЕЛКОВ

Молекулярную массу белка измеряют различными физическими методами: гравиметрическим, вискозометрическим, осмометрическим, ультрафильтрационным, гельфильтрационным, электрофоретическим, оптическим. Полученную величину принято называть физическим значением молекулярной массы белка; она определяется с точностью в несколько сотен, а иногда и тысяч дальтон. У многих белков в настоящее время выяснена первичная структура, что дает возможность рассчитать молекулярную массу с точностью до сотых долей дальтона, т. е. получить химическое значение молекулярной массы белка. Обычно оперируют значениями физических молекулярных масс белков, варьирующих для всего спектра природных белков в очень широких пределах (табл. 3).

34

Таблица 3

Молекулярная масса, степень асимметрии молекул и иэоэлектрические точки некоторых белков

Белок Молекулярная масса Степень асимметрии молекулы Иэозлектрическа» точка

Миоглобин кашалота 17600 3,0 7.0

Пепсин 35000 4,0 1,1

Альбумин яичный 46000 4,4 4,6

Гемоглобин лошади 68000 4,3 6,6

¦у-Глобулин человека 160000 6,0 , 7,3

Катализа 250000 5,8 6,7

Фибриноген человека 450000 17,5 5,4

Уреаза 483000 4,3 4,9

Тиреоглобулин свиньи 630000 9,2 4,5

Антипневмококковый сывороточный глобулин лошади 920000 20,1 4,4

Гёмоцианин улитки 6600000 4,8 4,7

Определение молекулярной массы белка гравиметрическим методом ведут в аналитических ультрацентрифугах (рис. 15). Принцип количественного изучения размеров взвешенных частиц в центробежном поле А. В. Думан-ский выдвинул еще в 1913 г., и он же пытался определить размеры частиц по скорости оседания в обычных лабораторных центрифугах. Однако первая ультрацентрифуга с оптической приставкой, позволяющей наблюдать и фотографировать процесс седиментации (оседания) частиц, была построена шведским физико-химиком Т. Сведбергом десятью годами позже. При вращении ее ротора развивалось центробежное ускорение, превышающее ускорение силы тяжести всего в 150 раз.

В современных типовых ультрацентрифугах это превышение достигает 300000,

Рис. 15. Устройство ультрацентрифуги:

1 и 2—верхняя и нижняя стальные плиты; 3— стенка стального цилиндра; 4—стальная игла с подвешенным ротором (!&• -5—привод ротора; б— термопара; 7—монтажная плита; 8—электромагнитный затвор; В—металлический патрубок, соединяющий вакуумную камеру с фотоаппаратом; 10, 13—верхнее и нижнее кварцевые окна; 12—стальной хвостовик ротора в направляющей втулке; 14— гнездо ротора для ячейки, в которой наблюдают оседание белковых частиц

35

а в специализированных—900000—1200000. Данную величину называют относительным центробежным ускорением или фактором разделения: 0p=G>2r/g, где ю—угловая скорость ротора, рад/с; г-—расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белка, см; g—ускорение силы тяжести, см/с2. Таким образом, например, запись 100000 g означает, что центробежное ускорение в месте расположения ячейки в роторе ультрацентрифуги превышает ускорение силы тяжести в 100000 раз. Величина достигаемого в ультрацентрифуге фактора разделения—одна из важнейших ее характеристик.

Исследуемый раствор белка помещают в небольшую прозрачную для световых лучей ячейку, которую вставляют в специальное гнездо ротора. Молекулы белка в этой ячейке под действием центробежной силы, развиваемой при вращении ротора, постепенно оседают на дно. Фотоприставка к ультрацентрифуге позволяет делать снимки содержимого ячейки через определенные промежутки времени и определять таким образом скорость оседания белковых частиц. Определение молекулярной массы белка методом ультрацентрифугирования ведут двумя способами: по скорости седиментации белковых молекул и по седиментационному равновесию.

В первом случае измеряют скорость перемещения в ячейке ультрацентрифуги границы растворитель—белок, относя ее к величине развиваемого центробежного ускорения, т. е. находят константу седиментации: s=v/o)2r, где v—скорость перемещения границы растворитель—белок, см/с, ю2г—центробежное ускорение, см/с2. Размерность s выражают в секундах. Величина константы седиментации, равная Ю-13 с, принята за единицу и названа све-дбергом (S, или Св). Вводя значение экспериментально найденной константы седиментации в формулу, рассчитывают молекулярную массу белка:

м_ RTs М-Д(1-р/о)'

где R—газовая постоянная; Т—температура (по шкале Кельвина); D—коэффициент диффузии; р—плотность растворителя; а—плотность белковых частиц.

Во втором случае измеряют концентрацию белка с, и с2 в двух точках ячейки на расстоянии хг и х2 от центра ротора в тот момент, когда после определенного срока работы ультрацентрифуги в ячейке установится седиментационное равновесие, т. е. равенство между числом оседающих и диффундирующих в обратном направлении молекул белка. Расчет молекулярной массы белка ведут по формуле, вводя в нее экспериментально найденные значения с19 с2, хх и х2:

м= 2RTlnc2lct

(l-p/o-K^-x?)'

где ю—угловая скорость, а остальные обозначения те же, что в предыдущей формуле.

Из остальных перечисленных выше физических методов определения молекулярной массы белков широко применяют еще два: гельфильтрационный и электрофорет