аемых электронов Восстановленная форма ft, в.

Цитохром Ci(Fe3+) 1 Цитохром c1(Fe2+) 0,23

Цитохром c(Fe3+) 1 Цитохром c(Fe2+) 0,25

Цитохром a (Fe3 +) 1 Цитохром a(Fe2+) 0,29

1/2 02 + Н20 2 н2о2 0,30

Феррицианид 2 Ферроцианид 0,36

Нитрат 1 Нитрит 0,42

Цитохром аъ (Fe3+) 1 Цитохром «з (Fe2 +) 0,55

Fe3 + 1 Fe2+ 0,77

1/2 02+2Н + 2 н2о 0,82

Именно здесь происходит сопряжение окисления с фосфорилированием АДФ (рис. 129), так как разность энергетических уровней электрона, транспортируемого с огромной скоростью (около 1 мс от одного переносчика к другому), вполне достаточна для синтеза макроэргической связи и составляет 51 кДж для /, 36—для //и 80,7 кДж для ///точки сопряжения. В целом интенсивность окислительного фосфорилирования определяется энергетическим зарядом, т. е. соотношением моно-, ди- и трифосфатов аденозина:

Энергетический заряд=

0,5 [АДФ]+[АТФ] [АМФ ] + [АДФ ] + [АТФ ]

Внутренняя двухслойная мембрана

Наружная двухслойная мембрана

Кристы (впячивания внутренней мембраны)

Метрике (пространство, замкнутое внутренней мембраной)

Межмембранное пространство (между внешней и внутренней мембраной митохондрии)

АТФ-синтеза , (Н+- АТФаза)

\ W -----/

Цепи дыхательных ферментов

Матрикс

; ^%Внутренняя^^ :; белково-липидная/

Межмембранное пространство

Рис. 130. Структура митохондрии (А) и схема расположения ферментов дыхательной цепи и АТФ-синтазного комплекса в ее внутренней мембране (6):

ФМН-—флавопротеин с флавинмононуклеотидом в качестве кофермента; FeS—железосерные белки; Q—убихинонпротеин, Ь, с иг—цитохромы; а-а —цитохромоксидаза

423

J

Рис. 131. Трансмембранный перенос электронов и протонов и сопряжение его с синтезом АТФ (обозначения те же, что на рис. 129)

Мембраны, несущие ферменты переноса электронов и сопряженного с ним фосфорилирования, называются сопрягающими. К ним относятся: внутренняя мембрана митохондрий, мембрана тилакоидов хлоропластов зеленых растений, мембрана хроматофоров фотосинтезирующих бактерий и клеточные мембраны аэробных бактерий, обладающих дыхательным типом энергетики. Они характеризуются толщиной в 7,0—9,0 нм, преобладанием белков над липидами (2:1), низким содержанием холестерола и наличием кардиолипина; примерно третья часть входящих в их состав белков принадлежит ферментам дыхательной цепи, собранным в ансамбли (рис. 129),— в каждой митохондрии клеток печени крысы, например, их содержится несколько тысяч.

Наиболее полно изучены структура и функция сопрягающей мембраны митохондрий. Наряду с дыхательным ансамблем ферментов в ней находится АТФ-синтазный комплекс, ответственный за образование АТФ. Каким же образом расположены они в митохондрии? Ответ на этот вопрос дает рис. 130. И тот и другой ферментные комплексы локализованы во внутренней мембране митохондрий (рис. 130, Б), причем АТФ-синтазный комплекс представлен так называемыми грибовидными выростами, которые усеивают внутреннюю мембрану и обращены в сторону матрикса митохондриальных частиц.

Проблема сопряжения окисления с фосфорилированием необыкновенно сложна и далека еще от окончательного разрешения. Ранние гипотезы по этому вопросу: гипотеза химических переносчиков (Е. Слейтер, 1953) и кон-формационная гипотеза (П. Бойер, 1964) представляют в настоящее время лишь исторический интерес, хотя отдельные элементы той и другой в некоторой мере присутствуют в общепризнанной сейчас хемиосмотической гипотезе П. Митчела, поддержанной и развитой в нашей стране благодаря трудам В. П. Скулачева и сотр.

Согласно хемиосмотической гипотезе, именно структурные и функциональные особенности сопрягающей мембраны (этот термин введен в биоэнергетику В. П. Скулачевым) обеспечивает биосинтез АТФ. В процессе функционирования дыхательной цепи ферментов в сопрягающей мембране митохондрий, не проницаемой ни для НАДН, ни для протонов, происходит активный перенос шести Н+ из матрикса в межмембранное пространство (рис. 131) на каждую пару электронов, проходящих по электронотранспортной цепи. По поводу механизма этого переноса высказаны разные мнения. Сущность некоторых из них ясна из рассмотрения рис. 131. Предполагают также, что перенос протонов идет при участии протонных транслоказ—специфических белков, локализованных в сопрягающей мембране и обеспечивающих

424

Рис. 132. Протонная помпа, сопряженная с цитохром с-оксидазой митохо-ндриальной мембраны

При М = 140000 цитохром ооксидаза состоит из 7 субъединиц, содержащих 2 атома Си и 2 атома Fe (в составе тема, показан овальным кружком), соединенных координационными связями с атомами азота радикалов гис. Так как атомы Си н Fe цитохрома а аъ находятся на расстоянии 3,5 нм, то возможен только тоннельный перенос электронов между ними. Цитохромоксидаза, изменяя кон-формацию при переносе электронов, либо сама выполняет функцию протонной помпы, либо для этого служит тесно прилегающий к ней белок. Как видно из рисунка, механизм активирования молекулярного кислорода цитохромоксндазой вполне аналогичен таковому у диоксигепаз и некоторых монооксигеназ, т. е. осуществляется за счет передачи на кислород электронов с Fez+ и Си*.

перенос протонов сопряженно с транспортом электронов при помощи белкового комплекса, как, например, в случае питохромоксидазы (рис. 132) или НАДН: б-оксидоредуктазы.

В результате создается трансмембранная разность потенциалов, так как с внешней стороны внутренней мембраны митохондрий, в межмембранном пространстве, накапливаются Н+, а на внутренней ее стороне, в матриксе,— ОН- (см. рис. 131). Возникает градиент электрохимического потенциала Н+ (его обозначают как Дцн+)- Он складывается из градиента электрического потенциала—А\|/ и градиента концентрации водородных ионов—АрН и является движущей силой синтеза АТФ.

Естественно, что ионы Н, накопившиеся в межмембранном пространстве митохондрии, перенесенные туда за счет потерянной электронами энергии в процессе их транспорта по дыхательной цепи ферментов и перехода с более высокого энергетического уровня в окисляемом субстрате на более низкий энергетический уровень в активированной молекуле кислорода (см. рис. 129), стремятся вернуться в митохондриальный матрикс. Энергезированная, электрически заряженная внутренняя мембрана митохондрий способна деэнергезироваться, разрядиться. Этот процесс осуществляется при помощи протонной АТФазы.

Протонная АТФаза (Н+-АТФаза)—липопротеиновый комплекс, гидроли-зующий АТФ сопряженно с трансмембранным переносом водородных ионов против их электрохимического градиента (Дцн+). Энергия для такого переноса Н+ против градиента их концентрации черпается за счет энергии распадающейся макроэргической связи в молекуле АТФ при ее гидролизе. В условиях нарушения целостности комплекса FoFx (рис. 132) митохондрий, Н+-АТФаза ускоряет именно этот процесс, обеспечивая обратный транспорт Н+ и создание Арн+- Но в составе энергезированной митохондриальной мембраны, при нормальном состоянии комплекса Fo-Fi, функция протонной АТФазы

425

Рис. 133. Строение протонной АТФазы (пояснение в тексте)

сводится не к переносу ионов водорода из матрикса в межмембранное пространство, а, наоборот, к транспорту протонов внутрь митохондрии, к снятию электрохимического градиента Ни, само собой разумеется, к синтезу (сопряженно с переносом Н+ с внешней стороны сопрягающей мембраны на ее внутреннюю сторону) АТФ. Поэтому ее называют также АТФ-синтазой, что подчеркивает ее истинную функцию в митохондриальной мембране.

АТФ-синтаза (протонная (АТФаза) представлена двумя белковыми комплексами, состоящими, в свою очередь, из субъединиц (рис. 133,Л). Первый из них, полностью «утопленный» в сопрягающую мембрану и пронизывающий ее насквозь, состоит из трех видов гидрофобных полипептидных цепей (с различающимися в зависимости от объекта молекулярными массами порядка 19000—24000, 13500—18000 и 5400—8400 в соотношениях 1:2:5 или близких к этому) и обозначается как FQ. Его функция состоит в доставке протонов из межмембранного пространства, куда он открывается, ко второму белковому комплексу, плотно к нему примыкающему.

Второй комплекс включает в свой состав пять различных белков и выступает, будучи частично погруженным, из сопрягающей мембраны в виде грибо-

426

видного выступа. Это /^-фактор или сопрягающий фактор, непосредственно ответственный за биосинтез АТФ. Его молекулярная масса, слегка варьирующая в зависимости от объекта выделения, составляет в среднем 368000, а субъединицы представлены полипептидами с М ~ 57 ООО (а), 53 ООО (Р), 34 ООО (у), 17000 (5) и 10000 (е). По данным ряда авторов, субъединичный состав сопрягающего фактора подчиняется формуле а3р3у5е. Полагают, что каталитический центр, ускоряющий реакцию синтеза АТФ из АДФ и Н3Р04, находится на Р-субъединице, а а-субъединица прикрывает его от воздействия ингредиентов митохондриального матрикса. Есть также мнение, что е-субъ-единица регулирует деятельность протонной АТФазы, ингибируя ее способность гидролизовать АТФ. Аналогично построены и действуют хлоропластная и бактериальная Н+-АТФазы.

Каким же образом возникает АТФ при посредстве АТФ-синтазы? На этот вопрос еще нет исчерпывающего ответа, но предложено несколько заслуживающих внимания концепций.

Первая из них сводится к предположению, что протоны, поступающие по протонпроводящему каналу F0, активируют неорганический фосфат (Р„), связанный активным центром Р-субъединицы, отнимая от него ОН-груггау (реакция элиминирования воды). Одновременно ОН-группа концевого фосфата АДФ, также присоединенного к активному центру р-субъединицы, теряет протон за счет взаимодействия с ОН "-группой матрикса (где ОН "-группы накапливаются в результате переноса Н+ в межмембранное пространство, см. рис. 131). Активированные фосфат и АДФ соединяются и образуют АТФ (рис. 133, Б, 1).

Вторая концепция состоит в допущении, что ионы Н в активном центре сопрягающего фактора активируют фосфат и карбоксильную группу одной из Субъединиц Fx -фактора, в результате чего возникает фосфоэнзим, где фосфат присоединен макроэргической связью. При последующем взаимодействии АДФ и фосфоэнзима образуется АТФ (рис. 133, Б, 2). Здесь в видоизмененном состоянии представлена гипотеза переносчиков.

Третья концепция исходит из предположения, что роль транслоцируемых в /^-фактор протонов состоит в изменении конформации ^-фактора. Обладая не менее чем двумя центрами связывания АДФ и неорганического фосфата, Fx -фактор способен синтезировать АТФ из АДФ и Р„, если связывающий центр находится в закрытом состоянии. При этом АДФ и Р„ в нем находятся в окружении аминокислотных радикалов, способствующих отнятию молекулы воды и синтезу АТФ (рис. 133, Б, 3, правая сторона Fi-фактора). При транслокации протонов центр связывания открывается, и АТФ из него поступает в матрикс (левая сторона ^-фактора на рис. 133,Z>,J), а ее место занимают АДФ и Рн. Новый цикл конформационных перестроек переводит этот центр связывания в закрытое состояние с одновременным высвобождением готовой АТФ из другого связывающего центра, переходящего в открытое состояние. Легко заметить, что в этом объяснении механизма биосинтеза АТФ использованы идеи конформационной гипотезы сопряжения окисления с форфорилиро-ванием.

В последнее время появились новые точки зрения на механизм АТФ-синтазной реакции. А. Д. Виноградов предложил кинетическую модель, в соответствии с которой синтез АТФ в АТФазном комплексе и гидролиз АТФ ^-АТФазой идут разными путями и каталитически ускоряются разными формами фермента, причем синтазные центры локализованы на а-субъединице, а гидролазные—на р-субъединице. Л. Ф. Дмитриев обосновал вариант химической гипотезы, где роль интермедианта играет энергизи-рованный липидный радикал сопрягающей мембраны и учитывается роль электрохимического потенциала и внутримембранных протонов в процессе

427

сопряжения окисления с фосфорилированием.

Кроме биосинтеза АТФ, электрохимический потенциал Лин+, возникающий на сопрягающей мембране и переводящий ее в энергетически заряженное, энергезированное состояние,, является источником энергии для механической работы (например, для движения жгутиков у мутантов бактерий, утративших синтез АТФ за счет сопряжения окисления с фосфорилированием, вращения хлоропластов у харовых водорослей, вбуравливания цианобак-терий в ил и т. п.), для поддержания осмотического давления и переноса веществ против градиента концентрации, для теплопродукции при утрате митохондриями дыхательного контроля (например, при переохлаждении жи-Рис. 134. Гигантские разветвленные митохон- ВОТНЫХ, В период испарения цветами дрии в клетках почечных канальцев эфирных масел для привлечения насекомых и др.), для обращения вспять переноса электронов в дыхательной цепи ферментов, для синтеза пирофосфата и полифосфатов (как макроэргических соединений).

Источником энергезированного состояния мембраны может быть также возникновение электрохимического потенциала AuNa+, что характерно для некоторых морских бактерий. У них ApNa+ используется для приведения в движение жгутиков, создания солевых градиентов и, что самое важное, для синтеза АТФ при посредстве Na+-зависимой АТФазы (Ка+-АТФ-синтазы). В связи с этим возникает вопрос о статусе других металлозависимых АТФаз (Na+, К+-АТФазы, Са2+-АТФазы) и не исключено, что эта область исследований станет в перспективе «горячей точкой» биоэнергетики.

Сказанное, по мнению В. П. Скулачева, наводит на мысль о том, что возникновение Ацн+, а в ряде случаев AuNa+ на сопрягающей мембране есть универсальнъгй способ запасения энергии в клетке, предшествовавший ее консервированию в макроэргических связях АТФ.

Более того, современные наблюдения говорят о том, что в клетках, например мышечных, существует митохондриальный ретикулум, при помощи которого митохондрии связаны в единую цепь или представляют собой одну гигантскую разветвленную митохондрию. По ее энергезированной мембране Ацн+ может передаваться на значительные расстояния для того, чтобы в нужном месте обеспечить синтез необходимого количества АТФ или выполнить иные функции, присущие мембранному электрохимическому потенциалу (рис. 134).

ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ БАЛАНС РАСПАДА УГЛЕВОДОВ И ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Если суммировать уравнения реакций, которые осуществляются при брожении, гликолизе или полном окислении глюкозы по апотомическому или дихотомическому пути, то легко прийти к следующим результатам.

428

Неполное окисление

Брожение

С6Н12Об + 2Н3Р04+2АДФ —>2С2Н5ОН + 2С02+2АТФ+2Н20

ГликОлиз

СбН12Об + 2Н3Р04+2АДФ —»2СН3 - СН (ОН) - СООН+2АТФ+2Н20 Полное окисление

Апотомический путь

СбН х 2Об+АТФ + 7Н20 +12НАДФ+—> 6С02+АДФ+Н3Р04+ + 12НАДФН + 12Н+

Дихотомический путь

СбН12О6+4Н3РО4+4АДФ + 10НАД++2ФАД+2Н2О—> —> 6С02+10НАДН+10Н+ + 2ФАДН2+4АТФ

Если принять, что все атомы водорода, снятые с субстратов при полном окислении, будут направлены в дыхательную цепь ферментов и их дальнейшая передача на кислород пройдет сопряженно с фосфорилированием, то в каждом случае должно образоваться определенное, но разное число молекул АТФ. Размеры синтеза АТФ, или, что то же самое, энергетический эффект рас