ический.

Первый состоит либо в определении объема элюента, необходимого для выноса белка из колонки с гелем сефадекса (Ке), и соотнесении его со свободным объемом колонки (V0), либо в установлении длины пробега белка в тонком слое сефадекса на пластинке. И тот и другой показатели связаны зависимостью со значением молекулярной массы белка. Пользуясь калибровочными графиками, построенными по VJ V0 или по длине пробега маркерных (т. е. с известной молекулярной массой) белков, находят молекулярную массу исследуемого белка.

36

Второй метод состоит в измерении пути, пройденного белком при электрофорезе в полиакриламидном геле; здесь тоже существует зависимость между молекулярной массой белка и длиной пробега. Еще более отчетливо она выявляется при сопоставлении торможения пробега белка при переходе от электрофореза его в геле с меньшим содержанием акриламида к электрофорезу в геле с большим содержанием акриламида. В этом случае также строят калибровочные графики по маркерным белкам и по ним находят молекулярную массу неизвестного белка.

Другие физические методы определения молекулярных масс белков: по светорассеянию, вязкости и осмотическому давлению белковых растворов, по данным рентгеноструктурного анализа и электронной микроскопии—используют крайне редко.

. Некоторое распространение имеет химический метод. Сущность его заключается в количественном определении в составе белка элемента или аминокислоты, содержащихся в нем в наименьшем количестве. Затем проводят расчет минимальной молекулярной массы, исходя из того, что в молекуле белка не может быть менее одного атома элемента или одного аминокислотного остатка. Однако об истинной молекулярной массе белка этот метод не всегда дает правильное представление. Например, гемоглобин (белок крови человека и животных) содержит 0,34% железа. Так как в гемоглобине не может содержаться менее одного атома Fe, то минимальная молекулярная масса гемоглобина рассчитывается по пропорции: 0,34 части Fe соответствует 100 частям белка, 56 частей Fe (один атом) соответствуют х частям белка, отсюда х=(56-100)/ 0,34 = 16 500. Истинная молекулярная масса гемоглобина равна 66 000—68 000, т. е. учетверенной минимальной молекулярной массе. Это естественно, так как молекула гемоглобина содержит 4 атома Fe. Таким образом, химический метод определения молекулярной массы белков в определенной мере условен.

ФОРМА БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ

О форме белковых молекул судят на основании математической обработки данных, получаемых при ультрацентрифугировании белковых растворов. Для этой же цели широко используют метод двойного лучепреломления в потоке. Он основан на изменении оптической характеристики раствора белка, находящегося в движении, по сравнению с раствором, находящимся в покое: в первом происходит ориентация вытянутых белковых частиц по направлению движения раствора, и это сопровождается феноменом двойного лучепреломления. Кроме того, форма белковых частиц может быть установлена при непосредственном наблюдении в электронном микроскопе. Исчерпывающие данные о форме белковых молекул и топографии их поверхности дает рентгеност-руктурный анализ.

С помощью этих методов выяснено, что белковые частицы бывают и шарообразными, и сильно удлиненными—до нитевидных образований. В большинстве случаев они имеют вытянутую форму и построены асимметрично. Степень асимметрии выражают отношением длинной оси частицы Ъ к ее короткой оси а. Данные о степени асимметрии (Ь/а) молекул некоторых белков приведены в табл. 2, а их форма показана на рис. 16.

, Белки, у которых степень асимметрии равна 1 (частицы шарообразны), довольно редки. Чаще всего эта величина бывает в пределах от 3 до 6 (эллипсовидные или палочкообразные молекулы). В некоторых случаях степень асимметрии достигает 200 и более (нитевидные белковые частицы). В общем,

37

Рибонуклеаза Пепсин Гемоглобин р-Лактомобшшн

Альбумин fif-Глобулин ^ dig-Глобулин t сывороточный сывороточный сывороточный М~69Ш$Чфнм М=дООШ?Чфнм Н'ЭОООту'Юрнм

оС,- Глобулин '^L^mW Х-Глобулин _ сывороточный р.-Липопротеин сывороточный М=200Ш:№31Юнм сывороточный М*ЖЖ-Ш2/бнм

Фибриноген М^500В0;1/р*Щ0нм

Коллаген М-350000; ф*Э0Р,Онм

Рис. 16. Форма молекул некоторых белков

Под названием каждого белка указаны его молекулярная масса в дальтонах ¦ размеры молекулы в нанометрах

длина белковых молекул средней молекулярной массы лежит в пределах нескольких десятков, а толщина—нескольких нанометров.

Более поздние работы, в которых была детально раскрыта полная структура некоторых белков, показали, что белковые молекулы асимметричны во всех трех измерениях. Так, молекула миоглобина—одного из белков мышечной ткани (М= 17600)—имеет размеры 2,5 х 3,5 х 4,5 нм (см. с. 71 и 72). Многим белкам, особенно ферментам, присуща многолопастная структура с наличием в их молекулах глубоких расщелин, выпячиваний и впадин, на дне которых располагаются функционально активные центры.

АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ БЕЛКОВ

Одним из наиболее распространенных методов исследования химического состава белковых тел является гидролиз. Белок нагревают с растворами кислот или щелочей при температуре 100—105° С примерно в течение суток. Чаще всего используют 20%-ный раствор НС1, обеспечивающий глубокий гидролиз белка с минимальным разрушением аминокислот, из которых он построен. В последнее время для ускорения реакции гидролиза белков используют иммобилизованные (закрепленные на носителях) протеолитические ферменты и ионообменные смолы, что обеспечивает полное соответствие содержания аминокислот в гидролизате соотношению их в белке.

Впервые А. Браконно (1820), используя кислотный гидролиз, выделил из белка (желатины) аминокислоту—глицин, а Н. Любавин (1871) установил, что при ферментативном гидролизе белки распадаются до аминокислот. В последующее время было доказано, что аминокислоты являются почти единственными продуктами гидролиза белков. Первая аминокислота была получена из сока спаржи в 1806 г. С тех пор из растений, животных и микроорганизмов выделено несколько сотен различных аминокислот; в составе белков их обнаружено около 30, остальные существуют в свободном виде.

38

В настоящее время фракционирование аминокислот белковых гидролиза-тов ведут методом ионообменной хроматографии. В колонках с ионообменными смолами удается разделить набор белковых аминокислот на составляющие в течение 1,5—2 ч. Поток проявителя из колонки направляют в смеситель, куда поступает раствор нингидрина, реагируя с которым каждая из аминокислот образует сине-фиолетовый Руэмана. Подробно эта реакция описана в практикуме по общей биохимии1. Краска подается далее в фотоэлектроколориметр, связанный с самописцем, на ленте которого плотность окраски записывается в виде пиков; высота и ширина их соответствуют содержанию аминокислоты в гид-ролизате белка. Будучи скомпонованы в единый агрегат, перечисленные элементы и дополнительные устройства к ним образуют прибор, получивший название автоматического анализатора аминокислот (рис. 17). Этот прибор работает автоматически по заданной программе и определяет содержание аминокислот в гидролизате белка (включая и выполнение необходимых расчетов) за несколько часов почти без участия экспериментатора. Если анализатор оборудован компьютером, то на это уходит не более 2 ч.

Найденные в белках аминокислоты принято делить на две категории: постоянно встречающиеся и иногда встречающиеся в белках. Постоянно встречающихся в белках аминокислот насчитывается 18. Их названия, формулы и сокращенные обозначения приведены в табл. 4.

Кроме 18 аминокислот в состав белков постоянно входят еще два амида: амид аспарагиновой кислоты—аспарагин и амид глутаминовой кислоты— глутамин (сокращенно асн и глн, либо N и Q):

Рис. 17. Принципиальная схема определения аминокислот в гидролизате с помощью автоматического анализатора:

/, 2.3—сосуды с раствором нингидрина, буферным раствором для малой колонки, буферным раствором для большой колонки соответственно, 4. 5, 6—вшеосы для подачи соответствующих растворов; 7. 8—малая и большая хромато-графические колонки; 9—смеситель; 10—реакционная баня; //—фотоэлектроколориметр; 12—самописец

с-сн,-сн-соон

Аспарагин

о.

H,N

С-СН,—СН.-СН-СООН NHt

Глутамин

К группе иногда встречающихся в составе белков аминокислот принадлежат оксипролин (оксипирролидин-а-карбоновая кислота); оксилизин (а, е-диамино-6-оксикапроновая кислота); орнитин (а, 5-диаминовалериановая кислота); 3,5-дииодтирозин; а-аминоизомасляная кислота; N-метил-, N,N-диметил- и К^ДЧ-триметиллизин; N-метил-, N,N'-flHMeTHn- и N,N'-flHMe-тиларгинин; у-карбоксиглутаминовая кислота (глд); Р-карбоксиаспарагиновая

1 Здесь и далее даны ссылки на «Практикум по общей биохимии» Ю. Б. Филипповича, Т. А. Егоровой и Г. А. Севастояновой. 2-е изд., М., 1982.

39

i

кислота (аса); З-К-метилгистидин; М,ТЧ-диметилпролин; метиловые эфиры асп и глу и некоторые другие аминокислоты. Их структуры легко вывести исходя из формул, приведенных в табл. 4; строение орнитина, а-аминоизомасляной и у-карбоксиглутаминовой кислот таково:

H,N-(CH,)3-CH-COOH

I

NH,

Орннтин

с

н,с/ \чн„

а-Аммиомэомасляная кислота

H00St ¦ -

СН-СН,—СН—СООН

ноос/ ,«Hi

]-Карвокснглутаманоня кислота

Таблица 4

Аминокислоты, постоянно встречающиеся в составе белков

Аминокислота Формула .Сокращенное обозначение Когда, кем и в каком белке обнаружена

Глицин (аминоуксусная кислота) ch,^cooh 1 NH2 гли, g 1820 г., А. Бракон-но, в желатине

Алании -(а-аминопропио-новая кислота) СН,—СН—СООН 1 nh2 ала, А 1888 г., Т. Вейль, в фиброине шелка

Валин (а-аминоизовале-риановая кислота) снзх ,сн—сн—соон ch3/ 1 3 nh2 вал, V 1879 г., П. Шют-ценберже, в альбумине

Лейцин (ос-аминоизокапро-новая кислота) СН3Ч ХН—СН,—СН—соон сн3/ 2 I nh2 лей, L 1820 г., А. Бра-конно, в белках шерсти и мышц

Изолейцин (а-амино-Р-метил-валериановая кислота) 'сн,—сн,—сн—сн—соон 1 1 СНЭ nh2 иле, I 1904 г., Ф. Эрлих, в фибрине крови

Аспарагиновая (аминоянтарная) кислота ноос—сн,—сн—соон 1 nh2 асп, D 1868 г., Г. Ритт-хаузен, в растительном белке

Глутаминовая (а-аминоглутаро-вая) кислота ноос—сн,—сн,—сн—соон 1 ¦NH2 . глу, е 1866 г., Г. Ритт-хаузен, в растительном белке

Серия (а-амино-Р-окси-пропионовая кислота) но—сн,—сн—соон 1 nh2 сер, s 1863 г., э. Крамер, в серицине шелка

Треонин (а-амино-Р-окси-масляная кислота) сн,—сн—сн—соон 1 1 oh nh2 тре, Т 1921 г., д. Зелинский и В. Садиков, в кератине гусиного пера

Цистеин (а-амино-Р-тиол-пропионовая кислота) hs—сн,—сн— соон 1 nh2 цис, С 1901 г., Г. Эмбден, в яичном белке

40

Продолжение табл. 4

Аминокислота Формула Сокращенное обозначение Когда, кем и в каком белке обнаружена

Метионин (а-амино-у-метил-тиомасляная кислота) сн3—s—сн2—сн2—сн—соон nh2 мет, М. 1922 г., Ю. Мёл-лер, в казеине

Аргинин (а-амино-8-гуани-динвалериановая кислота) h,n— с—nh—(сн,).—сн—соон II 3 1 nh nh2 арг, r 1895 г., с. Хедин, в кератине рога

Лизин (а, Е-диаминока-проновая кислота) h2n—сн2—сн2—сн2—сн2—сн—соон nh2 лиз, К 1889 г., Э. Дрек-сель, в казеине

Гистидин (а-амино-Р-имида-золилпропирновая кислота) N-C-CH,-CH-COOH 1! ii 1 нс сн NH, V 1 н н,с-сн, н*с сн-соон V 1 гис, н 1896 г., А. Коссель и с. Хедин, в белке спермы осетра и казеине

Пролин (пирролидин-а-карбоновая кислота) про, Р 1901 г., Э. Фишер, в казеине

Фенилаланин (а-амино-'Р-фенил-пропионовая кислота) н . ^сн-сн сн ^с-сн4-сн-соон фен, F 1881 г., Э. Шульце и Ю. Барбиери, в растительном белке

сн-сн // Чч но-с с—сн,-сн-ссюн. \ / 1 CH=CH nh» сн нс с——C-CHt-CH-COOH 1 ii ii 1 нс с сн NHj w\ / сн n 1 н

Тирозин (а-амино-р-пара-оксифенил-про-пионовая кислота) тир. Y 1849 г., Ф. Бопп, в казеине

Триптофан (а-амино-Р-индо-лилпропионовая кислота) три, W 1901 г., Ф. Гопкинс и Д. Коль, в казеине

Важной особенностью белковых аминокислот является их оптическая активность. За исключением глицина, все они построены асимметрично и, следовательно, будучи растворены в воде или соляной кислоте, способны вращать плоскость поляризации света. Значение удельного вращения в большинстве случаев составляет от 20 до 30° влево или вправо и лишь иногда выражается большими или меньшими величинами. Из 17 оптически деятельных белковых аминокислот 7 характеризуются в водных растворах правым (+) и 10 левым (—) вращением, но все они относятся к L-ряду.

Лишь в составе гликопротеинов клеточных стенок бактерий и в антибиотиках обнаружены D-oc-аминокислоты: фен, глу, ала, лей, вал, про и др.

Тонкая структура аминокислот изучена методом рентгеноструктурного анализа. При его посредстве удалось построить объемные модели аминокислот;

41

Неполярные алифатические

Глицин

Неполярные ароматические

Фенилаланин

° Изолейцин

Дикарбоновые и их амиды

Треонин СН,

снон нч хсн уон

н о

нч„сн ,он

N С I и

н О

Иминокислота Пролии Н2С —СН2 Н2С СН с

NH \ О

Рис, 18. Объемные модели аминокислот, — имитируют

Аспаоагиновая кислота

СОО"

сн,

Н СН он >. s ч. * N С I II

н О

Глутаминовая кислота

СОО" CHj

нчхсн/>н

С II

о

Аспарагин

Основные

Лизин

NH, О СН

N

н

Глутамин

N Н

Цистеин

SH СНг

K^Crl „ОН

N С I и Н О

Приведенные формулы аминокислот в какой-то мере пространственные модели

некоторые из них показаны на рис. 18. Степень детализации представлений о пространственной структуре аминокислот иллюстрирует рис. 19, на котором приведены данные о межатомных расстояниях и валентных углах между атомами в кристаллической модификации глицина, полученные методом рент-геноструктурного анализа. Аналогичные данные этим же методом получены для всех постоянно встречающихся в составе белков аминокислот. На них основаны современные представления о тонком строении полипептидной цепи в высших структурах белковых молекул.

Рентгеноструктурный анализ кристаллов аминокислот показал, что ведущая роль в возникновении структуры кристаллов аминокислот и ее поддержании принадлежит разветвленной системе водородных связей, возникающих между молекулами аминокислоты, закономерно расположенными в структуре' кристалла (рис. 20). Свойство аминокислот образовывать водородные связи сохраняется и тогда, когда аминокислота является составной частью полипептидной цепи. Вследствие этого возникновение а-спиральной конформации (см. ниже) полипептидной цепи можно рассматривать как процесс внутренней кристаллизации полипептида.

Если расценить 18 постоянно встречающихся в составе белков ос-аминокислот с точки зрения их совокупных химических свойств, то поражает крайнее разнообразие взаимодействий, возможных между их радикалами.

Радикалом аминокислоты принято называть группировку атомов в ее молекуле, связанную с а-углеродным атомом и не принимающую участия в формировании полипептидной цепи. Химическая природа радикалов (табл. 4) позволяет осуществлять реакций солеобразования (по NH2- и СООН-груп