Биологический каталог




Самая главная молекула

Автор М.Д.Франк-Каменецкий

е в растворе весьма заметно влияет тепловое движение. Поэтому электрофорез — как будто бы никуда не годный метод разделения ДНК. Так думали долгое время. Все же выход был найден. Хотя броуновское движение нельзя устранить, его можно сильно ослабить, увеличив вязкость среды. Правда, чтобы эффект стал ощутимым, вязкость необходимо увеличить во много тысяч раз. Ни глицерин, ни сахар здесь не помогут. Пришлось прибегнуть к принципиально иным средствам повышения вязкости.

Из повседневного опыта мы знаем, что существуют вещества, вроде бы жидкие, но долго сохраняющие приданную им форму. Это — студни, желе. В науке и технике за ними закрепилось название «гели». Что же они из себя представляют, эти гели, и чем обусловлены их необычные свойства?

Гель — это концентрированный раствор полимера, в котором полимерные молекулы сильно перепутаны, а кое* где сшиты друг с другом химическими связями. В результате весь гель пронизывает единая трехмерная полимерная сеть, ячейки которой заполнены растворителем. Эта сеть служит как бы арматурой, придающей всей конструкции необычную для жидкости жесткость. Полимерная арматура составляет по массе ничтожную часть всего геля — несколько процентов. Основная масса геля приходится на растворитель. Способность переходить в гелеобразное состояние — одно из поразительных свойств макромолекул, которое еще ждет своего всестороннего изучения и технических применений.

Живая природа широко использует замечательные свойства гелей. Роговая оболочка и стекловидное тело, заполняющее всю внутреннюю часть глаза, есть не что иное, как гели. Полимерным компонентом служат белки, растворителем, разумеется,—вода. Издавна гели используются человеком в кулинарном деле. Студни и желе содержат в качестве полимерного компонента белок соединительной ткани — коллаген. Пожалуй, еще чаще мы сталкиваемся с другим белковым гелем — сваренным вкрутую (или всмятку) яичным белком. Мармелад — это тоже гель.

Использование геля как среды, где проводится электрофорез, полностью устранило трудность, связанную с броуновским движением. Червеобразные молекулы ДНК, подобно угрям, запутавшимся в рыбацкой сети, оказываются фиксированными в полимерной сетке геля. Лишь под действием электрического поля они очень медленно ползут, извиваясь, к аноду, едва протискиваясь сквозь тесные ячейки сетки. Разрешающая способность метода гель-электрофореза оказалась настолько высокой, что не слишком длинные фрагменты ДНК, отличающиеся всего на одно мономерное звено, четко отделяются друг от друга в виде хорошо различимых полосок.

Как читают ДНКовые тексты

Итак, с помощью рестриктаз можно нарезать ДНК на множество фрагментов. Метод гель-электрофореза позволяет выделить каждый фрагмент в изолированном виде. Это делается совсем просто — после выключения электрического поля гель разрезают обычным скальпелем на кусочки, чтобы каждый кусочек содержал одну полоску, одно скопление фрагментов ДНК строго определенной

^лины. Остается только прочесть последовательность каждого из фрагментов. Но как это сделать?

Над этой проблемой бились многие годы. На какие ухищрения только ни шли! Предлагали, например, пришивать к каждому нуклеотиду данного сорта, скажем, к аденино-вому, соединение, содержащее атомы урана и смотреть в электронный микроскоп, в который такие тяжелые атомы можно, в принципе, разглядеть, как эти метки распределены вдоль цепи одиночной нити ДНК. Затем пришивать к тиминовым н т. д. Однако, несмотря на многолетние усилия, получить вразумительные результаты не удалось.

В конце концов проблема была решена чисто химическим методом. Идея метода была предложена советским ученым Е. Д. Свердловым (Институт биоорганической химии АН СССР) в 1972—1973гг. Окончательно она была реализована в 1977 г. американскими учеными А. Макса-мом и У. Гилбертом. Поясним сущность метода на примере однонитевых фрагментов ДНК. На практике метод может использоваться и для двунитевых фрагментов.

Итак, пусть у нас есть образец, состоящий из тождественных друг другу однонитевых фрагментов ДНК с неизвестной последовательностью. Прежде всего к одному (определенному) концу фрагмента (напомним, что одиночная нить ДНК имеет направление — ее концы отличаются друг от друга) пришивают с помощью специального фермента радиоактивный фосфор 82Р. Будем называть меченый конец началом. Другой конец каждой молекулы не несет метки. Далее образец делят на четыре части. К первой добавляют вещество, рвущее ннть ДНК после любого аденинового нуклеотида (А). Реакция ведется с таким расчетом, чтобы в среднем приблизительно один А на фрагмент был атакован. Из исходной смеси фрагментов строго равной длины реагент сделает набор фрагментов разной длины. При этом нас интересуют только те фрагменты, которые несут радиоактивную метку. Если, скажем, А стоят в исходном фрагменте на местах 1, 3,7,13,21, 25 и 26, то под действием реагента обязательно появятся несущие метку фрагменты длиной в 1, 3, 7, 13, 21, 25 и 26 нуклеотидов, но не будет ни одного такого фрагмента другой длины.

Аналогичным образом три другие части исходного раствора обрабатываются веществами, рвущими цепь после Т, Г и Ц. Затем все четыре образца параллельно разгоняются в одном и том же аппарате для гель-электрофореза. После выключения поля на гель накладывают фотопла

г

Yf 25*

1Q И1 -1Z1J m19 -17 -18 -19 -ZJ -21 ZZ Z3 VZb -Z5--Z8" -27

А г

А Г Г

г

А Г

а т

г

А Т

Г

г т г

А U U

т

А

А Т

стинку, на которой отпечатываются те полоски в геле, которые несут метку (именно поэтому длины немеченных фрагментов не имеют значения). Результат такого эксперимента схематически показан на рис, 16. Последовательность непосредственно читается по электрофореграмме. Она приведена слева. Длина фрагмента, который может быть расшифрован этим методом, ограничивается разрешающей способностью метода гель-электрофореза.

Реально за один опыт удается прочесть фрагменты длиной по 300-500 звеньев. Это очень высокая производительность, не доступная существующим методам определения последовательности в белках.

Рис. 16. Метод Свердлова — Максама — Гилберта (схема).

Для того чтобы определить последовательность всей молекулы ДНК, очевидно, недостаточно определить последовательности всех ее фрагментов, полученных прн разрезании ее на куски. Необходимо еще знать, в каком порядке стыковать фрагменты. Чтобы это узнать, надо нарезать ДНК еще раз с помощью другого набора рестриктаз и вновь определить последовательности фрагментов. По перекрыванию последовательностей, полученных при различных способах разрезания, удается установить порядок следования фрагментов. Эту работу делает ЭВМ.

Первые неожиданности

В науке, да и не только в науке, часто бывает так, что находят вовсе не то, что ищут. Все ждали от первых последовательностей интересных сведений об устройстве промежутков между генами. Было множество предположений о том, как они должны быть устроены. Однако данные оказались разочаровывающими. Ничего особенного, в общем-то, не нашли — последовательности как последовательности. Ожидали, что расшифровав последовательности нескольких промоторов, которые узнает одна и та же РНК-полимераза, можно будет сразу догадаться, как она это делает. Ан, не тут-то было! Хотя последовательности оказались чем-то похожими друг на друга, но чем именно, — не вполне ясно. Так пока и непонятно, как белки узнают определенные последовательности ДНК, каковы принципы такого узнавания. Это одна из проблем, еще ждущих своего решения.

Чего ожидали меньше всего, так это каких-то неожиданностей в самих генах, то есть в участках ДНК, кодирующих последовательности аминокислот в белках. Ведь код, казалось, был твердо установлен, было четко известно, что каждому белку отвечает свой определенный участок ДНК, который, собственно, и есть ген. Короче, все опять свято верили в незыблемость основной догмы молекулярной биологии. От шока, вызванного открытием ревертазы, к середине 70-х годов уже оправились. И вот расшифровали первую ДНК — из вируса кишечной палочки, известного под кодовым названием ФХ174 (читается «фи-десять-сто-семьдесят-четыре»). И вдруг оказалось, что у него на одном и том же участке ДНК записана информация о двух белках!

Как же это может быть? Представьте себе, в руки вам попала книга, в которой промежутков между словами нет, а слова разделяются стрелками. Сверху строк стоят одни стрелки, а внизу —другие. Деля текст на слова с помощью верхних стрелок, вы читали бы допустим «Анну Каренину», а по нижним «Поднятую целину». Скажете, это невозможно? Действительно, такого длинного текста, насколько я знаю, не существует. Но короткий текст такого типа я помню с детства. Вот он:

НАПОЛЕОНКОСИЛ^АВУПОЛЯКИПЕЛИ

соловьями

А как обстоит дело у ФХ174 — показано на рис. 17.

Мы видим, что последовательность гена Е находится целиком внутри последовательности гена D. При этом последовательности аминокислот белков Е и D не имеют между собой ничего общего, так как они считываются со сдвигом фазы считывания. В этом ситуация в ДНК ФХ174 неожиданней и интересней, чем приведенный выше лингвистический пример. Ясно, что теоретически возможна запись на одном и том же участке ДНК максимума информации о трех белках. Такое перекрывание сразу трех генов, правда, на небольшом участке, происходит в фаге G4.

Хотя явление перекрывания генов было открыто еще в 1977 г., до сих пор нет никаких вразумительных объяснений, как такое может получиться в ходе эволюции. Если

J7 Свр ~ Гм - Зал -Трв- Глу-„*

F 10

Л* (MSM) -Вйл - АР5 -Тра^ТрВ -Лей - Три-*», J}.„ —Цис -Вал -Тар - Гли - Трв - Лей - Асгт - Фвн -Вал-...

... -Г-Г-игГ~Т-Т-Т№'&-Т-А-Ц-Г^

ПО ^ W 19QАрз -Лиз - Глр Л... - Ала-Глу ~Гли-Вал~Mam г С8Р~Ла$-Гли-„; ,.. -Г-Ц-Г'Г-А-№-Г-А-Г'Т'Т-А\Т-^

* " ' "' ' X—TIT чгт IT I—)

4UP <у fe, . Ш

Рис. 17. Участок ДНК ФХ174 и синтезируемые иа нем белковые цепи.

не считать этого удивительного феномена, то в остальном расшифровка первых вирусных последовательностей подтвердила ранее установленные факты. Была проведена проверка п

страница 13
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

Скачать книгу "Самая главная молекула" (2.26Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.09.2019)