Биологический каталог




Самая главная молекула

Автор М.Д.Франк-Каменецкий

ьтатов этих манипуляций. А началось все с маленькой, на одну страничку, заметки в журнале «Nature» от 25 апреля 1953 г., подписанной двумя именами, мало кому известными в то время — Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик.

В заметке излагалось мнение авторов о том, как устроена молекула дезоксирибону клеи новой кислоты. Сообщалось, что она состоит из двух антипараллельных полинуклеотид-ных цепочек, завитых в двойную спираль; что внутри двойной спирали находятся азотистые основания, образующие как бы начинку кабеля, а оболочка кабеля построена из отрицательно заряженных фосфатных групп. Азотистые основания из противоположных нитей образуют пары согласно принципу комплементарности: аденин (А) всегда против тимина (Т), а гуанин (Г) против цитозина (Ц) (рис 30). Пары оснований располагаются строго перпендикулярно оси двойной спирали, подобно перекладинам в перевитой веревочной лестнице.

Эта структура, которую, по всеобщему убеждению, ДНК имеет при физиологических условиях, получила название В-формы. Структура ДНК сильно меняется только если молекулу поместить в совершенно необычные условия, скажем, в очень концентрированный раствор спирта (нет, не в водку, а гораздо более крепкое питье — в почти что 80° раствор). Но в широком интервале внешних условий структура ДНК, как показывали многочисленные данные, оставалась практически неизменной.

Как это ни покажется странным, до недавнего времени, однако, не было строго доказано, что ДНК — это действительно двойная спираль. Дело в том, что экспериментальные данные, на которых основывались Уотсон и Крик, а также те, кто шел за ними, не могут трактоваться вполне

Рис. 30. Так устроены уотсон-криковские пары оснований. На рисунке правильно выдержан масштаб, относящийся к расстояниям между ядрами, но размеры атомов сильно занижены На самом деле основания в парах нельзя сильнее сблизить, так как это привело бы к «налезанию» атомов водорода одного основания на аюмы кислорода и азота другого. Замечательной чертой строения уотсон-криковских пар является то, что обе пары имеют почти точно одинаковые размеры (расстояния между атомами азота, связанными с сахаром). Именно благодаря этому в структуру двойной спирали «вписываются» любые последовательности пар оснований.

однозначно. Всегда остается, в принципе, возможность того, что тем же данным, в пределах экспериментальной точности, удовлетворит какая-то совсем другая структура.

В конце 70-х годов, например, много шума наделала модель новозеландских и индийских ученых, согласно которой две нити ДНК не переплетаются друг с другом, а идут параллельно бок о бок (ее так и назвали БОБ-форма).

Первоначально утверждалось, что БОБ-форма дает такую же рентгенограмму, как и В-форма. Когда выяснилось, что это не так, стали говорить, что, мол, в волокнах и кристаллах, где изучают ДНК методом рентгеноструктурного анализа, она может быть и находится в В-форме, а в растворе, и уж подавно — в клетке, она в БОБ-форме, Большим преимуществом модели считалось отсутствие топологических проблем при репликации (не нужно раскручивать спираль).

Несостоятельность БОБ-формы как модели ДНК при обычных условиях была показана многими методами. Однако возникшие вокруг этой модели споры оказались полезными. Они заставили придирчиво пересмотреть вопрос о том, насколько мы уверены, что модель Уотсона и Крика

Рис. 31. Два предельных случая стыковки кольцевой молекулы ДНК в месте одноннтевого разрыва; а — удачная стыковка; б — не удачная.

справедлива во всех главных чертах, а не только в том, что ДНК состоит из двух нитей и последовательности в них взаимно комплементарны.

Наиболее убедительные доказательства были получены в опытах с кольцевыми ДНК. Это было сделано все тем же Джеймсом Уонгом, имя которого нами не раз упоминалось. Уонг использовал методику Келлера, о которой было рассказано в гл. 8. Эта методика позволяет различать с помощью гель-электрофореза две молекулы ДНК, отличающиеся на единицу по числу витков сверхспирали. Чтобы понять суть опытов Уонга, представим себе, что мы имеем кольцевую ДНК, содержащую один однонитевой разрыв и что эта ДНК предоставлена самой себе в растворе.

Как будет выглядеть ситуация в месте разрыва? Может быть, так, что та нить, в которой имеется разрыв, готова к «стыковке», т. е. нужно только образовать связь (рис. 31, а). А может быть, что концы разорванной нити

ДНК не могут состыковаться, как показано на рис. 31, б. От чего это зависит? Это определяется тем, чему равно отношение N/y0t где у0 — число пар оснований, приходящихся на один виток спирали в линейной ДНК при данных условиях.

В модели Уотсона—Крика у0 = 10, но мы сейчас должны забыть об этом, так как цель описываемых опытов в том и состояла, чтобы найти экспериментально значение y0t а не предполагать его заранее известным. Так, ситуация, изображенная на рис. 31, а,будет в том случае, если N/y0 — К

где k — любое целое число. Если N/y0 = k + ^, то будет

иметь место ситуация, показанная на рис. 31, б. Возможны, естественно, и все промежуточные положения. Представим теперь, что мы меняем величину N, увеличивая длину ДНК (это можно делать, как того хочет экспериментатор, методами генной инженерии). Иными словами, пусть N — = Л/ 0 + т, причем, для простоты, предположим, что N0 таково, что N0/y0 = k. При разных т мы будем иметь то ситуацию рис. 31, а, то ситуацию рис. 31, б, то промежуточные ситуации.

Теперь добавим к каждому из образцов ДНК, отличающихся величиной т, фермент лигазу, зашивающий разрыв. Фермент может сделать свое дело, только если разорванные края подходят друг к другу «стык в стык». Что же, он зашьет только те молекулы, для которых N/y0 = &? Нет, не только. Дело в том, что молекула ДНК — это все-таки микроскопический объект. Одна из принципиальных особенностей микрообъектов, отличающая их от макрообъектов, к которым мы привыкли в повседневной жизни, состоит в том, что микрообъекты испытывают значительные изменения своей формы и размеров вследствие просто теплового движения. В нашем макромасштабе эти изменения не заметны, мы их просто не видим.

В свое время мы уже говорили о том, что тепловое движение изгибает линейную ДНК, не дает ей вытянуться как спице. Оно же не дает кольцевой ДНК принимать энергетически наиболее выгодную форму окружности. Молекула принимает в пространстве причудливую, постоянно меняющуюся форму. Кроме того, в результате теплового движения постоянно меняется угол поворота между соседними парами оснований в двойной спирали.

Используя обозначения, уже введенные нами в главе 8, можно сказать, что вследствие теплового движения проис

ходят случайные изменения величин Wr и Tw. Следовательно, случайным образом меняется и их сумма Tw ~f Wr. Конечно, эти изменения происходят вокруг положения равновесия, вокруг наиболее вероятных значений этих величин, то есть Tw = N/y0l Wr = 0, следовательно, Tw + Wr « N/yQ.

Тепловое движение приводит к тому, что с заметной вероятностью реализуются значения Tw ~f Wr, значительно

отличающиеся от этого среднего значения.

О)

б)

Рис. 32. Два предельных случая распределения молекул замкнутой кольцевой ДНК по величине Lk.

Поэтому, когда мы добавим фермент лигазу к образцу, состоящему из строго одинаковых молекул ДНК, содержащих однонитевой разрыв, и потом проанализируем результат на гель-электрофорезе по методу Келлера, то обнаружим, что получился набор молекул, отличающихся друг от друга величиной Lk. Ведь как только произошло залечивание однонитевого разрыва, молекула стала замкнутой кольцевой, и для нее вступает в силу теорема Уайта, согласно которой Lk = Tw -f- Wr. Сюда входят те самые Tw и Wr, которые были в момент замыкания.

Если отложить по оси абсцисс значение Lk, а по оси ординат количество молекул с данным Lk в образце, то получится распределение, изображенное на рис. 32. Для разных N/y0 будут получаться очень похожие распределения. Но все же они будут несколько отличаться друг от друга.

В чем же будет состоять отличие? Чем должно отличаться распределение молекул по Lk для ситуации на рис. 31, а (т. е. когда N/yQ = k) от ситуации рис. 31, б (т. е. когда N/y0 = k + 1/а)?

В первом случае лигаза может зашить молекулу, находящуюся в наиболее выгодном, наиболее вероятном состоянии. Во втором — не может. Поэтому в первом случае максимуму распределения будут отвечать молекулы ДНК, ь во втором — в максимуме никаких молекул не будет. В последнем случае пики, отвечающие молекулам, будут сдвинуты на одинаковое расстояние влево и вправо от максимума распределения.

Вот на это небольшое, но четко регистрируемое экспериментально отличие в распределениях молекул по величине Lk, и опирался Уонг при определении точного значения 7о* Как он это делал? Чтобы понять, как он действовал, предположим, что опыт начинается с такого значения N0t для которого iV0/Yo — К то есть максимуму распределения отвечает пик (рис. 32, а). Будем увеличивать N звено за звеном (*V = N0 + 1, ЛГ0 -|~ 2,N0-\~mt ...)• При этом максимум распределения сместится, перестанет отвечать пику, распределение пройдет через картину, изображенную на рис. 32, б, а затем при некотором т1 впервые вновь максимум совпадет с каким-то пиком. Ясно, что Уо — т}.

Правда, точность такого определения невелика, не выше, чем zhl, так как величину т нельзя менять меньшими порциями. Но давайте увеличивать т дальше. Ясно, что если максимум распределения k-й раз совпал с каким-то пиком и это отвечает значению т = mk, то у0 — mfo/k.

Если величина mk измеряется с точностью ztl, то точность определения уо будет составлять ±\lk. Таким образом, метод позволяет не просто оценить величину у0, но измерить ее с любой желательной степенью точности. Уонг установил, что у0 = Ю»5.

Тем самым Уонг подтвердил правоту Уотсона и Крика. Тому, что у него получилось небольшое отличие в значении уо от уотсон-криковской цифры 10,0, не следует придавать серьезного значения.

Замечательной чертой результата Уонга является то, что он получен для изолированных молекул в растворе. Ведь со времени классических работ М. Уилкинса и Р. Франклин, все сведения о детал

страница 25
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

Скачать книгу "Самая главная молекула" (2.26Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(01.04.2020)