ьной структуре ДНК получались на основе рентгеновских данных, полученных для волокон, в которых молекулы сильно взаимодействуют друг с другом.

Итак, ДНК в растворе находится в В-форме — в этом теперь уже нет никаких сомнений. Но это относится к не-сверхспирализованной ДНК. При сверхспирализации структура основной части молекулы не меняется заметным образом, но некоторые участки с характерными последовательностями могут радикально менять свою структуру. Вспомним про перевертыши и кресты, существование которых доказано экспериментально. А какие еще изменения структуры ДНК могут происходить? Играют ли они какую-либо биологическую роль?

Z-форма

Как мы уже говорили, Уотсон и Крик, а также их последователи, занимавшиеся моделированием структуры ДНК, опирались на данные по рассеянию рентгеновских лучей от волокон ДНК. Это были именно волокна, а не кристаллы, так как естественные, выделенные из клеток молекулы ДНК не кристаллизуются. Причина этого понятна — молекулы ДНК слишком длинные, чтобы из них можно было получить кристалл.

Определенная упаковка молекул при частичном высушивании раствора происходит — они укладываются подобно бревнам в запани (на лесосплаве), только не в двух измерениях, как на поверхности воды, а в трех. Промежутки, как и в запани, заполнены водой. Рассеяние рентгеновских лучей от подобного частично упорядоченного расположения молекул дает довольно богатую информацию, но не достаточную для однозначного восстановления структуры молекул, исходя только из рентгенограмм. Это обстоятельство и явилось причиной долгих споров о том, правильно ли Уотсон и Крик «угадали» структуру ДИК в волокнах.

После опытов Уонга создалась, в определенном смысле, парадоксальная ситуация. Стало ясно, что в растворе изолированные молекулы ДНК имеют структуру, в своих основных чертах соответствующую модели Уотсона—Крика. А в волокнах, в условиях возникновения взаимодействия между молекулами? Не изменяется ли структура? Специалисты, занимающиеся моделированием ДНК и расчетами того, как происходит рассеяние рентгеновских лучей от этих моделей, убеждали, что только В-форма ДНК может дать наблюдаемую картину. Но могли оставаться сомнения, не упустили ли они из виду что-либо.

Проблема была бы решена, если бы удалось все же получить кристаллы из ДНК, исследовать рассеяние рентгеновских лучей от этих кристаллов, а потом строго решить обратную задачу восстановления структуры по картине рассеяния. Именно так определяют пространственное строение обычных химических соединений любой сложности, а также белков. Но для ДНК это сделать не удавалось.

Ясно, что для длинных молекул или для коротких молекул, имеющих разную длину или разную последовательность, нет шансов получить кристаллы. Надежда была на то, что если взять короткие молекулы, содержащие около 10 пар оснований и имеющие одинаковую длину и последовательность, то их удастся как-то закристаллизовать. Но получение кристаллов — это весьма кропотливое дело. Нужно варьировать маточный раствор, из которого ведется кристаллизация, так что требуются очень большие количества вещества. А где взять много кусочков ДНК строго заданной длины? Такие препараты стали доступны только в конце 70-х годов благодаря потрясающим успехам в химическом синтезе ДНК с заданной последовательностью.

Успехи химиков в этой области действительно поражают. 20 лет назад синтез Кораной троек нуклеотидов разной последовательности вызвал сенсацию и в конечном счете принес автору Нобелевскую премию. (Как, возможно, помнит читатель, эти тринуклеотиды позволили провести полную расшифровку генетического кода, см. гл. 2.)

Сегодня можно заказать небольшой ящик размером с пишущую машинку. На ящике кнопки с буквами А, Т, Г, Ц. Вы нажимаете кнопки в том порядке, какую вы хотите получить последовательность (но не более 20 нуклеотидов), засыпаете в ящик исходные инградиенты, также выпускаемые промышленностью, и идете обедать. Потом вы можете сходить в библиотеку или на семинар, и вернувшись через несколько часов, обнаружите в выходном устройстве вашего ящика несколько миллиграммов препарата, который вы заказали.

Понятно, что это чудо химической и инженерной мысли решает все проблемы, связанные с искусственным синтезом гена. Из лоскутков по 20 нуклеотидов можно при помощи лигазы сшить ген любой длины. Это решает также проблему получения в больших количествах коротких кусков ДНК для их кристаллизации. Впрочем, такие машины появились в самом начале 80-х годов, но в конце 70-х в некоторых лабораториях, занимавшихся синтезом генов, уже умели быстро синтезировать лоскутки ДНК, правда, вручную.

Первыми получили хорошие кристаллы маленьких кусочков ДНК в лаборатории Александра Рича в Массачусетском технологическом институте (США). Кристаллы были из гексануклеотидов.

ц Г ц Г ц Г

гцгцгц

Каково же было удивление Рича и его сотрудников, когда, проделав все необходимые очень трудоемкие процедуры, они получили, наконец, структуру своих кусочков. Эта структура не имела ничего общего с моделью Уотсона и Крика!

Нет, разумеется, у нее были нормальные пары ГЦ и даже кусочек образовывал отрезок двойной спирали, но на виток спирали приходилось не 10, а 12 пар оснований. Но главное не это. Главное, что спираль была не правая, как в В-форме, а левая!

Имелся еще целый ряд принципиальных отличий этой новой структуры, названной авторами Z-формой, от В-формы ДНК. Название происходит от того, что, в отличие от В-формы, в которой сахаро-фосфатный остов образует плавную винтовую линию, в Z-форме эта линия имеет зигзагообразный вид (рис. 33).

Что же получается, неужели все-таки модель Уотсона— Крика оказалась в конечном счете неверной? Ведь первая же структура ДНК, найденная с помощью абсолютно надежных методов рентгеновской кристаллографии, оказалась принципиально отличной от В-формы.

Нет, открытие американских ученых, при всей своей сенсационности, не носит столь радикального характера. Опыты с кольцевыми ДНК однозначно свидетельствуют о том, что спираль ДНК в растворе правая и на виток спирали приходится 10 пар, что соответствует В-, а не Z-форме. Так что же, значит в кристалле вследствие межмолекулярных взаимодействий структура двойной спирали столь сильно меняется? Нет, дело и не в этом.

Как удалось установить, два фактора привели к тому, что изученный гексануклеотид оказался в Z-форме. Во-первых, строго чередующаяся последовательность Г и Ц, и, во-вторых, очень высокая концентрация противоионов, полностью заэкранировавших электростатическое поле фосфатных групп ДНКР. Диккерсон и его сотрудники установили, что невыполнение любого из этих условий приводит к переходу ДНК в В-форму. Они определили структуру в кристалле ДНК другой последовательности, в частности, додекамера

ЦГЦГААТТЦГЦГ

ГЦГЦТТААГЦГЦ

Он дал В-форму. Отсюда следует, что как только исчезает достаточно длинный участок строго чередующихся Г и Ц, сразу же ДНК оказывается в В-форме.

Z-форма В-форма

Рис. 33. Так выглядят объемные модели Z- и В-формы ДНК. Черные линии нарисованы, чтобы показать ход сахаро-фосфатной цепи.

Приближение к нормальным ионным условиям так же делает Z-форму менее выгодной, чем В-форма, даже для гексануклеотида, который исследовал Рич. При обычных условиях, по крайней мере в линейной ДНК, Z-формы быть не должно. Ну, а в сверхспирализованной?

Конечно, сверхспирализация должна делать Z-форму более выгодной, так как изменение знака спирали из положительного на отрицательный в отрезке ДНК снимает напряжение в остальной части отрицательно сверхспирализованной молекулы. Поэтому вполне естественно предположить, что в сверхспирализованной ДНК участки, имеющие чередующуюся последовательность Г и Ц, будут переходить в Z-форму. Так ли это?

Пока не удалось решить этот вопрос, ответ зависит от того, какова энергия перехода В—Z для участка ДНК. Ведь помимо регулярной В-формы, образование Z-формы должно стать более выгодным, чем образование крестообразной структуры, чтобы эта форма существовала. Ведь последовательность

... ЦГЦГЦГ... ... ЦГЦГЦГ...

это перевертыш, так что вопрос о том, переходят ли участки ДНК с подходящей последовательностью в Z-форму, совсем не прост. Пока этот вопрос не исследован ни экспериментально, ни теоретически.

Так или иначе, но открытие Z-формы буквально всколыхнуло молекулярных биологов. Вместе с доказательством существования крестов в сверхспиральных ДНК, это открытие показало, что хотя в целом ДНК безусловно находится в В-форме, отдельные ее участки могут иметь резко отличающуюся структуру. Начался поиск этих и других структур в ДНК и выяснение их возможной биологической роли.

Подвижная ДНК

Одним из методов, очень много давших прн изучении молекул, и особенно молекулы ДНК, является метод построения пространственных моделей. Хотя представление о молекулах как вполне реальных пространственных объектах завоевало право на существование еще на рубеже XIX и XX веков благодаря работам Вант-Гоффа, пространственные модели стали входить в обиход лишь в середине нашего века, главным образом благодаря деятельности Лайнуса Полинга. Были изобретены и выпу* скаготся в разнообразном виде очень удобные разъемные модели атомов и атомных группировок, в которых строго выдерживается масштаб реальных молекул. С помощью этих моделей можно собирать молекулы любой сложности, даже такие сложные, как молекула ДНК. Именно изображения такого рода моделей приведены на рис. 33.

Каждый, кто выбрал своей профессией изучение структуры ДНК, проводит долгие часы за занятием, которое может показаться детской игрой — собирая и разбирая сложные конструкции из ярких пластиковых «кубиков». Но это очень серьезные игры. Без таких игр с моделями (тогда еще весьма несовершенными и изготовлявшимися кустарным способом) Уотсону и Крику ни за что не удалось бы придумать свою двойную спираль.

Модель воспроизводит реальную молекулу, увеличенную более чем в сто миллионов раз. Конечно, работать с такой модельной молекулой несравненно удобней, чем с реальной ДНК. С помощью моделей можно пытаться отвечать на вопросы, к решению которых никак не уда