ое. Это может быть связано с тем, что они даже в жидкокристаллическом состоянии образуют отдельную фазу внутри бислоя либо просто включаются в бислой в слишком малом количестве. Например, эфиры холестерола уже при концентрации в несколько процентов не смешиваются с липидами в ламелляриой фазе (1453]. Физико-химические исследования локализации убихинона в бислое не дали однозначных результатов, поскольку неясно, в какой степени этот хинон погружен в липидный бислой (см., например, [1477, 1391]). Одни соединения, например полиизо-преноиды, при введении в липиды приводят к снижению Тт, затрудняя эффективную упаковку липидов в гелевой фазе [1477, 1516, 809], другие же, например высшие жирные кислоты и спирты, напротив, вызывают возрастание Тт [889]. Некоторые малые гидрофобные молекулы, такие, как углеводороды с короткой цепью, по-видимому, образуют в бислое отдельную фазу и понижают Тт [950].

2.5. Модельные мембранные системы

Для изучения свойств индивидуальных липидов, липидных смесей и реконструированных липидно-белковых систем были созданы многочисленные модельные мембранные системы. Их можно раз-

Структура и свойства мембранных липидов 97

делить на три типа: 1) монослои; 2) плоские бислой; 3) липосомы и везикулы. Каждая их этих систем и многие их разновидности имеют свои достоинства и недостатки, однако получаемая с их помощью информация оказалась весьма ценной при разработке концепций, связанных с изучением биологических мембран. В этом разделе мы вкратце рассмотрим некоторые из модельных систем и обсудим возможности их использования.

2.5.1. МОНОСЛОИ НА ГРАНИЦЕ РАЗДЕЛА ФАЗ ВОЗДУХ-ВОДА

Многие молекулы с четко выраженными неполярными свойствами адсорбируются на границе раздела фаз воздух—вода [53], образуя слой толщиной всего в одну молекулу. Такой слой можно исследовать либо непосредственно на границе раздела, либо после его переноса на какую-либо подложку. Фосфолипиды и другие амфифильные молекулы образуют ориентированные монослои, в которых полярные группы контактируют с водной фазой, а углеводородные цепи обращены в воздух. Фосфолипиды образуют нерастворимые моиослои, поскольку концентрация липида в водной фазе пренебрежимо мала. Такие монослои традиционно изучают с помощью пленочных весов Лэнгмюра (кюветы Лэнгмюра). С одной стороны кюветы имеется подвижный поплавок, позволяющий измерять площадь поверхности, на которой могут образовываться монослои (рис. 2.23). Для формирования нерастворимого монослоя известное количество липида (обычно находящегося в летучем растворителе) наносят на водную поверхность. Весы Лэнгмюра позволяют точно измерить площадь поверхности (А) и поверхностное давление (*•) монослоя. Важным достоинством метода является возможность изменять эти параметры, поэтому он оказался особенно

Поп ла вон, соединенный с ве-

не. 2.23. Схематическое представление монослоя, образующегося в ванне Лэнгмюра 1482]. Полярные головки погружены в воду, а неполярные цепи обращены в воздух.

7-4016

98 Глава 2

полезным для изучения «поверхностно-активных» липидов, а также таких ферментов, как липазы [324], которые функционируют на границе раздела липид—вода. В моиослой можно включать белки, однако в большинстве случаев эта система малопригодна для изучения поведения интегральных мембранных белков. Для характеристики монослоев обычно используют диаграммы «давление— площадь». Примеры гаких диаграмм приведены на рис. 2.24. Они обладают двумя важными особенностями.

1. Изломы, которые отвечают кажущимся фазовым переходам из разреженной «жидкоподобной» или «газоподобной» фазы с низкой плотностью упаковки в более сжатое «твердоподобное» состояние с высокой плотностью упаковки. Фазовое поведение монослоев в каком-то смысле аналогично фазовым переходам бислоев [8%, 1160, 505].

2. Точка коллапса, в которой молекулы упакованы в монослое с максимальной плотностью. Дальнейшее сжатие монослоя приводит к его разрушению. По точке коллапса можно определить минимальную площадь поверхности, приходящейся на молекулу.

Насыщенная алкихьная цепь занимает площадь около 20 А, что совпадает с данными рентгеноструктурного анализа. Цепи, содер-

40 60 80 100 120

Площадь на моленулу,Д2

Рис. 2.24. Типичные диаграммы «давление—площадь» для фосфолипидных монослоев [698]. / — дибегеиоилфссфатидилхолии (22:0) в «твердоподобиой» фазе; // — ди-пальмитоилфосфатидилхолин (16:0), претерпевающий при сжатии фазовый переход из «жидкоподобиого» в «твердоподобное» состояние; /// — яичный фосфатидилхолин в «жидкоподобной» фазе.

Структура и свойства мембранных липидов 99

жащие г/ис-двойные связи, из-за меньшей плотности упаковки занимают большую площадь. Минимальную площадь поверхности, необходимую для фосфолипидов^ с двумя насыщенными цепями, можно оценить величиной 40—45 А2, что отвечает гелевой фазе бислоя. Минимальная площадь, занимаемая липидной молекулой с одной i/uc-двойной связью в цепи, по-видимому, близка к 60 А2. Если липидная молекула имеет объемную полярную головку, как у фосфатидилхолинов или ганглиозидов, то минимальная площадь поверхности, приходящейся на молекулу, возрастает.

Фазовый переход между жидкой разреженной фазой и жидкой конденсированной изучался во многих теоретических и экспериментальных исследованиях (см., например, [1160, 53]). При определенном давлении в монослое индуцируется температурный фазовый переход, который можно сопоставить с переходом, наблюдаемым в бислое. Например, при давлении в 15 дин/см монослой дипальми-тоилфосфатидилхолина претерпевает фазовый переход с Тт = 27 °С и АН0 = 8,7 ккал/моль. Это довольно близко к параметрам соответствующего перехода в бислое с 7~т = 41 °С и АН = 8,7 ккал/ моль. Пинк [1160, 505] показал, что различие в Tin для монослоя и бислоя можно объяснить в рамках довольно простой модели, учитывающей очень слабое притяжение между двумя монослоями, составляющими бислой. Это весьма важный момент, поскольку отсюда следует, что с термодинамической точки зрения бислой ведет себя в значительной мере как два почти независимых монослоя. Поэтому можно ожидать, что если два монослоя, образующие мембрану, имеют разный состав, то их физические свойства будут в определенной степени независимыми друг от друга. Конечно, это положение может измениться под действием трансмембранных белков или каких-либо других компонентов мембран. Подробно об этом пойдет речь в гл. 4. Обсуждаемая нами модель отвечает внутреннему давлению бислоя 2-15 дин/см = 30 дин/см. Внутреннее давление возникает потому, что силы, стабилизирующие бислой, должны компенсировать стерическое отталкивание как углеводородных цепей, так и полярных головок. Обычно величина этого давления, по оценкам [1160], лежит в интервале 12,5 — 50 дин/см, что формально соответствует величине поверхностного натяжения [683].

Следует отметить, что давление к, измеренное для монослоя, на самом деле представляет собой разность между поверхностным натяжением на поверхности с нанесенным монослоем (7) и поверхностным натяжением на границе раздела воздух—вода без монослоя (70):

* = (7о - 7)-

Самопроизвольное формирование монослоя на границе раздела воздух—вода, естественно, приводит к уменьшению поверхностного

7*

100 Глава 2

натяжения. Его можно рассматривать как отрицательное давление, возникающее благодаря взаимному притяжению молекул на границе раздела фаз, которое уменьшается под действием «поверхностно-активных» веществ, образующих монослой. Так, дипальмитоилфос-фатидилхолии, являющийся основным компонентом легочного сур-фактанта, уменьшает почти до нуля (у = 0) работу, затрачиваемую на изменение площади поверхности легкого при дыхании [598].

Очень сильное впечатление производят картины, наблюдаемые с помощью метода так называемой эпифлуоресценции, когда в микроскоп следят за флуоресценцией липидной метки, включенной в монослой [946, 1145]. Используемые метки встраиваются предпочтительно либо в гелевую, либо в жидкокристаллическую фазу. Когда обе фазы присутствуют одновременно, на рассматриваемой поверхности наблюдаются светлые и темные пятна. Это связано с разной интенсивностью флуоресценции метки в разных фазах. Яр-

S

Рис. 2.25. А. Кривые «давление—площадь» для монослоя дипальмитоилфосфатидил-холина на поверхности дистиллированной воды при 20 "С. Образец содержит 2 мол.% флуоресцирующего фосфолипида NBD-фосфатидилэтаноламина (см, табл. 5.1). В точке, помеченной стрелкой, была сделана фотография флуоресцирующего монослоя (Б). Темные пятна — «твердоподобные» домены, а сильно флуоресцирующие области — «жидкоподобные» домены, в которых накапливается флуоресцентная метка. Регулярность в расположении доменов, по-видимому, определяется электростатическими силами. Размер поля зрения равен примерно 200 мкм (в диаметре). Из работы (946). Фотография любезно предоставлена д-ром Н. McConnell.

Структура и свойства мембранных липидов 101

кая, постоянно меняющаяся картина, связанная с появлением твердой фазы, возникает в монослоях дипальмитоилфосфатидилхолина уже при давлении порядка 5 дин/см (20° С), и по мере увеличения давления размер областей твердой фазы растет, а жидкой уменьшается. В образце, представленном на рис. 2.25, на молекулу в монослое приходится в среднем около 60 А2. Эти исследования не только подтверждают сосуществование разных фаз, но и свидетельствуют о наличии в монослое дальней упорядоченности, которая стабилизируется, по-видимому, за счет электростатических взаимодействий [946].

2.5.2. МОНОСЛОИ НА ТВЕРДОЙ ПОДЛОЖКЕ

Монослои, образовавшиеся на границе раздела воздух—вода, можно перенести на твердую подложку, например на алкилирован-ное предметное стекло. Для этого достаточно просто прикоснуться этим стеклом к монослою [946]. За счет алкилирования поверхность стекла становится гидрофобной. Полярные головки липида после перенесения монослоя на такое стекло по-прежнему контактируют с водой. Таким образом можно исследовать монослои, перенесенные на твердую подложку при разных значениях поверхностного давления *•. В работах [946, 1145, 1565, 1450] было показано, что динамические свойства и термодинамические характеристики монослоев на подложке, как и монослоев на границе раздела воздух— Вода, близки к таковым для бислоев. Разработаны также флуоресцентные методы изучения ориентации молекул в монослое, находящемся на подложке [1450].

2.5.3. ПЛОСКИЕ БИСЛОЙНЫЕ МЕМБРАНЫ

Плоские мембраны обычно формируют путем нанесения акварельной кисточкой концентрированного раствора фосфолипида в таких растворителях, как декан, на перегородку из гидрофобного материала (например, из полистирола), в которой имеется небольшое отверстие (диаметром ~ 1 мм). Перегородка разделяет две камеры, содержащие водные буферные растворы. Большая часть растворителя переходит в воду, а липнды при соответствующих условиях сомопроизвольно образуют бислойную пленку, затягивающую Это небольшое отверстие. Такие мембраны часто называют бимолекулярными липидными мембранами (БЛМ), а поскольку они не отражают свет, то еще и черными липидными мембранами. Плоские

102 Глава 2

мембраны, полученные таким способом, можно использовать для изучения мембранных белков (например, ионных каналов [987, 988]), но их недостаток состоит в том, что они содержат следовые количества растворителя. Кроме того, они весьма нестабильны, особенно в присутствии небольших количеств детергентов и других примесей. Чтобы устранить проблемы, связанные с наличием следов растворителя, и облегчить включение в мембраны интегральных мембранных белков, была разработана другая методика приготовления плоских мембран [1009, 1010, 1011, 246]. В этом случае плоская мембрана формируется из монослоя на границе раздела фаз либо на кончике небольшой пипетки при ее простом погружении в раствор (рис. 2.26), либо на небольшом отверстии в перегородке из гидрофобного материала. Монослои, содержащие очищенные мембранные белки, можно получить на поверхности везикулярных белково-фосфолипидных дисперсий и использовать их для формирования плоских мембран. Кроме того, можно провести слияние мембранных везикул, содержащих ионные каналы, с предварительно сформированной плоской мембраной и таким путем включить в нее изучаемый белок (см. разд. 8.1.4).

Важным преимуществом плоских мембран является возможность проведения на них электрических измерений. Эта система особенно полезна для изучения пор, каналов или переносчиков, которые облегчают или ускоряют перенос заряда через бислой из одного водного компартмента в другой (гл. 8). В водные камеры нетрудно поместить электроды, растворы в них можно легко заме-

Рис. 2.26. Процесс формирования бислоя на кончике пипетки [1402]. На поверхности воды из реконструированных фосфолипидных везикул, содержащих изучаемый белок, образуется монослой (гл. 3). Пипетку погружают в раствор под положительным давлением (этап /), и при последующем ее вынимании (этап 2) монослой прикрепляется к пипетке своими полярными головками, при этом углеводородные хвосты оказываются обращенными в воздух. Затем пипетку снова погружают в раствор (этап 3), и на ее кончике формируется бислой.

Структура и свойства мембранных липидов 103

нять, а измерения тока и/или напряжения являются очень точными и отличаются высокой чувствительностью. Другая методика состоит в формировании мембран на кончике микропипетки (диаметром < 1 мкм) (рис. 2.26). Небольшой фрагмент бислоя на такой «пэтч-пипетке» можно использовать для проведения очень чувствительных электрических измерений с реконструированными очищенными мембранными белками (например, с ацетилхолиновым рецептором) и исследовать различные процессы на молекулярном уровне [1402] (см. разд. 8.1.4).

2.5.4. ПЛОСКИЕ БИСЛОЙНЫЕ МЕМБРАНЫ НА ТВЕРДОЙ ПОДЛОЖКЕ

Фосфолипидные бислой можно также формировать на твердых гидрофильных подложках (например, на оксидированных силиконовых пластинках), последовательно перенося два монослоя с границы раздела воздух—вода [1430]. Между твердой подложкой и липидными полярными головками, по-видимому, имеется водная прослойка. Таким способом можно получить стабильный бислой из монослоя с определенной средней площадью на молекулу. Эти бислой удобны для физико-химических исследований индивидуальных липндов, и, возможно, со временем они найдут применение и для изучения мембранных белков. В бислоях дипальмитоилфосфатидил-холина, приготовленных таким способом, происходит четкий температурных фазовый переход, как и в случае ламеллярных липидных дисперсий. Особенно ценны эти бислой для измерения латеральной диффузии мембраносвязанных молекул с помощью флуоресценции (см. гл. 5). Соответствующие результаты вполне согласуются с данными, полученными на других системах.

2.5.5. ЛИПОСОМЫ

Термин «липосомы« относится к любым липидным бислойным структурам, имеющим водное содержимое [312, 1417, 649]. Многие фосфолипиды при диспергировании в воде самопроизвольно образуют гетерогенную смесь везикулярных структур, состоящих из нескольких бислойных концентрических оболочек. Это были первые «липосомы», которые удалось охарактеризовать, и сейчас они называются мультиламеллярными везикулами (МЛВ). Большой интерес представляют моноламел