сь возникают проблемы, связанные с тем, что все стандартные белки имеют глобулярную форму, а исследуемый белок может быть не глобулярным, а слегка удлиненным. Такой белок с мол. массой 50 000 может элюировать со скоростью, соответствующей мол. мас-

Мембранные белки: характеристика и структурные принципы 119

се 100 000. В связи с этим колонка для гель-фильтрации должна быть прокалибрована в соответствии со значениями радиуса Стокса, т. е. с размерами «эквивалентной гидродинамической сферы», а кроме того, параллельно необходимо использовать какой-либо другой метод. Обычно измеряют скорость седиментации с помощью либо аналитического ультрацентрнфугирования, либо центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Коэффициент седиментации равен

о _ м(1 - ув) S ~ N6rVRc ' (31)

где м — молекулярная масса белка,

v — его парциальный удельный объем (величина, обратная

плотности), ¦ц — вязкость раствора (~- 1 сантипуаз), б — плотность раствора (~ 1 г/мл).

Поскольку е и г) известны, a Rc можно определить с помощью гель-фильтрации, остаются только две неизвестные величины — v и м. Для водорастворимых белков v можно вычислить исходя из аминокислотного состава [231] или непосредственно измерить либо просто принять равным 0,72—0,75 мл/г. Таким образом, измерив S0, можно найти м.

Рассмотрим теперь ситуацию с мембранным белком. Здесь возникают дополнительные проблемы, поскольку гидродинамическая частица — это белково-детергентный комплекс, поэтому Ми Св данном случае являются молекулярной массой и удельным объемом комплекса, W, и К,. К сожалению, v% нельзя оценить, не зная ничего о составе комплекса. В этом случае для нахождения молекулярной массы белка используют два метода.

1. Прямо измеряют количество связанного детергента на 1 г белка. Для этого используют спектральные методы или радиоактивно меченный детергент, а для выделения комплексов применяют различные методы, например гель-фильтрацию. Установив относительное содержание белка и детергента в комплексе, значение К, получают как средневзвешенное соответствующих величин для чистого белка и чистого детергента. После этого без труда находят М„, а поскольку соотношение между белком и детергентом в комплексе известно, находят молекулярную массу белка (см., например, [567, 1281]).

2. Измеряют S0 в средах с разными значениями плотности раствора q. Такие среды обычно получают, используя смеси НгО и D20. Из графика зависимости S° от q находят как мх, так и v%. При этом предполагается, что К, — это средневзвешенное соответствующих величин для чистого белка и чистого детергента.

К = (Доля белка) • уыпт + (Доля детергента) • К„ергет. (3.2)

120 Глава 3

Оценив Квело, и взяв ^детергент из таблиц (табл. 3.2), получают молекулярную массу белковой составляющей Л/„.

Для построения графика зависимости S0 от о проводят аналитическое центрифугирование (см. [567, 1401, 1281, 1213]). Можно проводить центрифугирование и в градиенте плотности сахарозы, используя смеси НгО и D20, но анализ результатов в этом случае гораздо сложнее, хотя принципиально не отличается от предыдущего случая [1357].

Альтернативный способ определения молекулярной массы нативной формы мембранного белка состоит в равновесном ультрацентрифугировании. Распределение вещества в состоянии равновесия таково, что наклон графика зависимости логарифма концентрации от г2 равен

а)2Л/(1 - Vq) Наклон =-— > (3J)

где г — расстояние от центра ротора до данной точки в центрифужной пробирке, ы — частота вращения.

Если величина V известна или ее легко оценить, как для большинства растворимых белков, эта задача решается достаточно просто. Что касается мембранных белков, то в этом случае определяют на-

Таблица 3.3. Связывание детергентов с некоторыми мембранными белками

Белок Детергент Количество связанного детергента, мг на 1 мг белка Ссылки

Ыа + /К*-АТРаза Са2 + -АТРаза Белок полосы 3 Ацетилхолиновый Тритон Х-100 Тритон Х-100 Тритон Х-100 Тритон Х-100 0,28 0,20 0,77 0,70 [558] [558] [558] [558]

рецептор Родопсин Переносчик ADP/ATP Инсулииовый Тритон Х-100 Тритои Х-100 Тритон Х-100 1,10 1,5 0,15; 0,31; 0,54 [558] [567] [1169, 7]

рецептор Инсулииовый Дезоксихолат 0,01; 0,03 [7]

рецептор Цитохром Тритон Х-100 0,6 [1281]

с-оксидаза Цитохром Лаурилмальтозид 0,55 [1401]

с-оксидаза

Мембранные белки: характеристика и структурные принципы 121

клон указанной прямой при разных значениях д, получаемых смешиванием НгО и D2O. Как и ранее, одновременно находят Мк и К, и далее определяют молекулярную массу белка [567, 1401, 1281].

Если в комплексе присутствует третий компонент (например, какое-то количество связанного липида) [567], возникают дополнительные проблемы. В любом случае все описанные процедуры весьма сложны и могут давать ошибочные результаты. Количество детергента, связанного с очищенными интегральными мембранными белками, может быть весьма существенным — от 0,3 до 1,5 от массы белка, и даже небольшие ошибки в этой величине приведут к значительному искажению молекулярной массы белка. В табл. 3.3 приведены данные о количестве детергентов, присутствующих в некоторых белковых препаратах. Заметим, что растворимые белки с этими детергентами не связываются [613 , 909, 223]; это опять свидетельствует о том, что за связывание с детергентом ответственна именно неполярная часть белка, обычно контактирующая с мембранными липидами.

3.3.3. МЕТОД РАДИАЦИОННОЙ ИНАКТИВАЦИИ [742, 1512]

Метод радиационной инактивации для определения размера мишени все чаще применяется при исследовании мембранных белков [741, 742, 1512, 524]. Изучать можно как очищенные белки, так и неочищенные препараты, в том числе интактные биомембраны. Суть метода состоит в определении доли белковых молекул, получающих повреждения при облучении. Для этого используют ферментативные методы связывания гормонов или других лигандов или спектральные методы. Процедура состоит в следующем. Образец, обычно замороженный, подвергают высокоэнергетическому облучению (например, облучают пучком электронов из синхротрона). Через разные промежутки времени отбирают пробы, размораживают их и проводят измерения. Повреждения белка под действием излучения (в частности, разрыв ковалентных связей) выявляют, например, с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН. Как показывает опыт, некоторые субъединицы полностью утрачивают биологическую активность при внесении радиационного повреждения в любое место полипептидной цепи. Ключевым моментом является то, что, чем крупнее белковая молекула, тем больше вероятность ее повреждения и, следовательно, вероятность инактивации. Эта вероятность зависит не от формы молекулы, а от ее массы. Обычно для того, чтобы облегчить интерпретацию результатов, параллельно облучают белок с известной молекулярной массой. Если исследуемый белок содержит более одной субъединицы, возникают определенные трудности при анализе результатов [1512]. Повреждение одной субъединицы не обязательно сопровождается разрывом ковалентных связей в других субъедини-

122 Глава 3

цах. Поэтому для ферментов, состоящих из разных субъединиц, обладающих неодинаковыми активностями, могут быть получены разные размеры мишени в зависимости от метода определения степени инактивации.

Примечательной особенностью метода является то, что его можно использовать для изучения интегральных мембранных белков in situ. Возникающие при этом артефакты и проблемы рассмотрены в работе [741]. Одна из очевидных проблем — необходимость использования высокоэнергетического излучения. В связи с этим большинство работ приходится проводить в сотрудничестве с лабораториями, в которых имеются соответствующие источники и освоены специальные методы анализа.

3.3.4. СПЕКТРАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ И ВТОРИЧНАЯ СТРУКТУРА

Для определения содержания а-спиралей и /3-слоев в мембранных белках используют несколько методов. В отсутствие трехмерной организации на их основе можно попытаться построить соответствующие модели. Чаще всего используется метод кругового дихроизма (КД). Все более широкое применение находят инфракрасная и рамановская спектроскопия, а также ЯМР.

1. Метод кругового дихроизма [183] основан на измерении разности поглощения лево- и правополяризованного света; эта оптическая активность является мерой хиральности молекул, или мерой их асимметрии. В дальней ультрафиолетовой области (от 190 до 240 нм) КД определяется в основном поглощением амидов карбонильных групп полипептидного остова. При наличии участков вторичной структуры, например а-спиралей, спектр КД имеет вполне определенные особенности, связанные с особенностями электронного окружения амидиых групп в этих структурах. Анализизуя спектр КД белков, его обычно представляют как сумму компонентов, отвечающих поглощению разных участков белковой молекулы: а-спиралей, /3-слоев и случайных клубков. Определив тем или иным способом спектры каждой из этих структур, производят их суммирование, подбирая соответствующие коэффициенты таким образом, чтобы было достигнуто наилучшее соответствие измеренному спектру. Подобранные весовые коэффициенты представляют собой ту долю, которая приходится в молекуле на каждый из типов вторичной структуры.

Эти методы были разработаны для растворимых белков, но нет никаких оснований сомневаться, что их можно с успехом применять и для мембранных белков. Скорее всего у последних имеются участки с такими же типами вторичной структуры, как и у растворимых белков, и при их изучении возникнут такие же трудности. Некоторые белки можно изучать in situ, используя суспензии мембран. Примера-

Мембранные белки: характеристика и структурные принципы 123

ми такого рода являются бактериородопсин из пурпурной мембраны Halobacterium halobium и Са2 + -АТРаза из мембраны саркоплазмати-ческого ретикулума. Очищенные мембранные белки можно исследовать с помощью КД и в присутствии детергентов, если поглощение последних в дальней УФ-области не слишком велико, или в составе реконструированных везикул. Здесь возникают две проблемы: 1) дифференциальное светорассеяние, когда размер мембранных частиц гораздо больше длины волны света; 2) выравнивание поглощения из-за концентрирования белка в мембранах или везикулах, т. е. из-за негомогенности его распределения в растворе. Эти артефакты могут быть весьма существенными, однако их можно учесть с помощью соответствующих методов [1539, 518, 1442, 1538, 1047].

К сожалению, для внутренних мембранных белков отсутствуют структурные данные высокого разрешения, поэтому точная интерпретация спектров КД невозможна. За исключением нескольких случаев, разные спектральные методы не использовались для изучения одного и того же белка и количественное сравнение результатов не проводилось. Интересно, что для бактериородопсина, который исследовали методами КД, ИК и ЯМР, во всех трех случаях были получены одинаковые результаты, свидетельствующие о значительном содержании в этом белке /3-слоев (разд. 3.5.2). Тем не менее у каждого метода имеются существенные недостатки. Так, данные о высоком содержании в бактериородопсине /3-слоев (-46%) [518] в значительной мере зависят от способа учета оптических артефактов [1047, 1526]. Судя по данным электронно-микроскопической реконструкции, харатеризующимся относительно низким разрешением (разд. 3.4.2), в бактериородопсине 80% приходится на долю а-спиралей, а /3-слои отсутствуют совсем [620]. Чтобы понять причину этих несоответствий, необходимо провести структурный анализ белка с атомным разрешением. Имеются еще два белка, пронизывающие мембрану, с высоким содержанием /3-структур: порин, присутствующий в наружной мембране Е. coli [737] (разд. 3.5.3), и а-токсин Staphylococcus aureus [1457]. Оба этих белка участвуют в образовании пор в бислое (гл. 8).

2. Инфракрасная спектроскопия и спектроскопия комбинационного рассеяния. Эти методы не только позволяют получить сведения о конформацни мембранных липидов (гл. 2), но и могут использоваться для исследования вторичной структуры белков [1590]. Колебательный спектр полипептидного остова зависит от типа вторичной структуры и дает информацию о содержании в молекуле а-и /3-структур. Этими Методами можно исследовать высушенные на воздухе пленки, водные суспензии мембран, а также очищенные белки как в присутствии детергента, так и в составе реконструированных везикул [1513, 32]. Например, по данным ИК-Спектроскопии с преобразованием Фурье комплекс Са2 + -АТРазы в мембране состо-

124 Глава 3

ит в основном из а-спиральных участков и участков, имеющих конформацию статистического клубка [832], а гидрофобный белок миелин (липофилин) в реконструированных везикулах имеет как а-, так и /3-участки [1414].

3. ЯМР-спектроскопия также может использоваться для изучения мембранных белков. Однако возможности метода в этом случае ограничены, что связано главным образом с относительно медленными движениями интегральных мембранных белков in situ и в комплексах с детергентом. Поэтому такой мощный метод, как двумерный ЯМР, который может дать детальную картину конформацион-ного состояния сравнительно небольших белков в растворе, пока непригоден для изучения мембранных белков. Более приемлем метод ЯМР твердых образцов. Большими возможностями обладают методы 2Н- и |3С-ЯМР, хотя до сих пор они применялись не очень широко. Получены данные об усредненной конформации остова [850] и динамике боковых цепей (гл. 5). Следует отметить, что методы ЯМР твердого состояния не только не используются широко, но в большинстве случаев их и нельзя использовать. Тем не менее в тех редких ситуациях, когда их применение оказывается возможным (например, при исследовании бактериородопсина [850]), они являются очень ценными.

3.3.5. ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ

Одним из наиболее важных методов характеристики очищенных мембранных белков несомненно является определение биохимической активности. При этом используются в основном такие же критерии, как и для растворимых белков, но могут возникать и свои трудности. Первая из них связана с тем, что биохимическая активность мембранных белков часто очень сильно зависит от связывания с белком липидов и детергентов. Потеря активности может быть как обратимой, так и необратимой. Целесообразно иметь какую-то оценку удельной активности исследуемого белка in vivo или в составе мембран до солюбилизации. Избыток детергента может оказывать ингибирующий эффект, например за счет разбавления неполярных субстратов в популяции мицелл и уменьшения ферментативной активности. Измеряя активность любого мембранного белка, необходимо иметь в виду, что in situ он находится в окружении липидов, обеспечивающих оптимальную активность. Вторая проблема связана с белками, обладающими «трансбислойной» активностью; примерами могут служить белки, образующие каналы, и транспортные белки (гл. 8). В этих случаях необходимо учитывать перемещение растворенных веществ из одного компартмента в другой (например, внутрь липосом и наружу). Подробно эти проблемы обсуждаются в гл. 6.

Мембранные белки: характеристика и структурные принципы 125

3.3.6. ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА И ХИМИЧЕСКОЕ СШИВАНИЕ

Многие мембр