альной) компонент [646]. А. Гидрофобные ионы. Вклады энергии Борна, энергии электростатического отображения и гидрофобных взаимодействий (сплошная кривая) для ионов, различающихся только зарядом, одинаковы. В то же время вклады дипольиой компоненты (пунктир) для гидрофобных катионов и аииоиов существенно различаются, что приводит к большей стабилизации анионов в бислое. Б. Гидрофобные ионы; общий профиль свободной энергии для гидрофобных анионов и катионов радиусом 4 А. Обратите внимание на места связывания ионов вблизи поверхности бислоя и относительно низкий барьер для переноса гидрофобных анионов через мембрану. Д Ионы радиусом 2 А. Энергетический барьер для траисмембранио* го переноса обычных неорганических ионов весьма высок. Для переноса анионов ои несколько ниже благодаря вкладу дипольного потенциала.

Взаимодействие низкомолекулярных соединений с мембранами 311

дит к стабилизации гидрофобных анионов в бислое. Обратите внимание на минимумы в профиле потенциальной энергии, соответствующие связыванию гидрофобных анионов вблизи поверхности мембраны — в той области, где локализуются эфирные группы фосфолипидов [438].

В результате влияния потенциала внутренних диполей гидрофобные анионы значительно прочнее связываются с бислоем и легче проникают через мембрану, чем гидрофобные катионы, имеющие очень близкую структуру: коэффициенты проницаемости для них различаются на шесть порядков (см. табл. 7.1), а константы связывания с бислоем — на четыре-пять порядков.

При связывании некоторых гидрофобных ионов (как анионов, так и катионов) с фосфатидилхолиновым бислоем наблюдается насыщение при концентрации ионов ~ 1 молекула на 100 молекул липида [439]. Это обусловливается электростатическим отталкиванием за счет поверхностного потенциала, образующегося при связывании ионов с поверхностью бислоя. Эти эффекты обсуждаются в следующем разделе.

7.3.3. ПОВЕРХНОСТНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ МЕМБРАНЫ [952, 68]

Поверхность большинства биомембран отрицательно заряжена в основном благодаря присутствию кислых фосфолипидов: обычно 10—20% мембранных липидов находятся в форме анионов. Отрицательным зарядом обладают и другие мембранные компоненты, например ганглиозиды или белки. Так, суммарный отрицательный заряд мембран тилакоидов в основном обусловлен белками [68]. Отрицательно заряженные группы, например фосфатные или карбоксильные, фиксированы на поверхности мембраны, и, естественно, их заряд нейтрализуется Противоионами. Однако противоионы подвижны, а не закреплены жестко на поверхности мембраны; их концентрация меняется в объеме водной фазы таким образом, что устанавливается определенный баланс между стремлением ионов к равномерному распределению по объему вследствие энтропийного фактора и электростатическим притяжением к поверхностным зарядам. В результате противоионы локализуются не на самой поверхности мембраны, а на некотором расстоянии от нее, создавая так называемый двойной диффузионный слой. С физической точки зрения он представляет собой поверхность мембраны с фиксированной плотностью зарядов и диффузное облако противоионов вблизи нее. Электрический потенциал в околомембранном слое раствора является функцией поверхностной плотности заряда, а также концентрации и валентности ионов в растворе. Наличие поверхностного потенциала приводит к ряду важных последствий, которые можно проверить экспериментально и объяснить с помощью довольно не-

312 Глава 7

сложных теоретических построений. В этом разделе мы не будем останавливаться на выводе соответствующих соотношений [952, 68], а сконцентрируем свое внимание на тех последствиях, к которым приводит существование фиксированных зарядов на поверхности мембраны.

В теоретическом плане задача состоит в определении величины электрической потенциальной энергии как функции расстояния от поверхности мембраны. После нахождения этой зависимости можно вычислить локальную концентрацию любого иона и количественно описать любое связанное с поверхностным потенциалом явление, например электрофоретическую подвижность везикул или электростатическое притяжение между двумя соседними мембранами. Соответствующая теория разработана в начале века Пои и Чапменом, а позднее, в 20-х гг., дополнена Штерном. Эта теория, получившая название теории Пои—Чампена или Пои—Чапмена—-Штерна, весьма успешно описывает связанные с заряженной мембраной электростатические эффекты.

В основу теории Гюи—Чапмена положены четыре предположения: 1) заряды равномерно распределены по поверхности мембраны; 2) ионы в растворе являются простыми точечными зарядами пренебрежимо малых размеров; 3) так называемые эффекты отображения — притяжение подвижных ионов при приближении к поверхности диэлектрика — считаются пренебрежимо малыми; 4) диэлектрическая проницаемость водной фазы считается величиной постоянной, одинаковой на поверхности мембраны и в объеме раствора. Каждое из этих предположений было проверено экспериментально и показано, что все они вполне разумны [951, 1596, 597]. Дополнение Штерна учитывает размеры связанных с поверхностью противоионов, что дает верхний предел числа ионов, которые физически могут связаться с мембраной.

Теоретические предсказания удобнее всего проиллюстрировать графически. На рис. 7.5 приведен профиль электрического потенциала в среде, содержащей соль одновалентных металлов (например, NaCl) в концентрации 0,1 М при разной поверхностной плотности заряда. Один заряд на 300 А2 соответствует примерно 20 мол.«Уо отрицательно заряженного фосфолипида, а один заряд на 60 А2 — би-слою из чисто отрицательного заряженного липида. Как можно видеть из рисунка, электростатические эффекты распространяются на довольно значительные расстояния от поверхности мембраны. Потенциал на поверхности мембраны (дг = 0) называется поверхностным, *о, и, очевидно, является функцией поверхностной плотности заряда. Рис. 7.5 иллюстрирует также влияние увеличения концентрации соли одновалентного металла в растворе. При высоких концентрациях соли электростатические эффекты в значительной мере нивелируются. При этом наблюдается уменьшение как поверхност-

Взаимодействие низкомолекулярных соединений с мембранами 313

Рис. 7.5. Зависимость электрического потенциала от расстояния х до поверхности заряженной мембраны, предсказываемая теорией Пои—Чапмеиа [952]. А. Профили потенциала при разных значениях поверхностной плотности заряда а. Одни заряд иа 60 А2 соответствует бислою, в котором каждая молекула липида несет один отрицательный заряд. Б. Профили потенциала при разных концентрациях одновалентного электролита (например, NaCl) в объеме раствора. Отметим, что от ионной силы зависит как величина поверхностного потенциала, так и расстояние от бислоя, иа которое простирается этот потенциал. При вычислениях предполагалось, что 20<Со липида находятся в анионной форме.

ного потенциала, так и эффективного расстояния, на которое простирается двойной электрически слой. Как следует из теории, для двухвалентных ионов экранирующий эффект выражен еще сильнее (рис. 7.6): влияние на поверхностный потенциал мембраны двухвалентных катионов, например Са2 +, проявляется при значительно меньших концентрациях, чем одновалентных. Эффекты, которые иллюстрирует рис. 7.6, не связаны с сорбцией ионов на поверхности мембраны, а обусловлены только экранированием. Наблюдаемое же довольно часто связывание двухвалентных катионов с заряженными группами на поверхности мембраны приводит к еще более выраженному уменьшению поверхностного потенциала (разд. 7.3.1).

Рис. 7.7 иллюстрирует влияние электрического потенциала на распределение анионов и катионов в растворе. Локальную концентрацию любого иона при известном электрическом потенциале несложно найти с помощью уравнения Больцмана:

С(х) = C(co)e-ZF*ixi/RT, (7.18)

314 Глава 7

Концентрация катиона, М

Рис. 7.6. Влияние двух- и одновалентных катионов иа поверхностный потенциал мембраны, несущей примерно одни отрицательный заряд иа 10 липидных молекул (-0,025 Кл/м2) [68]. Эффекты обусловлены только электростатическим экранированием и ие имеют отношения к связыванию катионов с заряженными группами иа мембране.

10

Расстояние,^

Рис. 7.7. Распределение концентрации иоиов вблизи поверхности заряженной мембраны (68). При расчетах для плотности отрицательного заряда было взято значение, соответствующее ситуации, когда заряжены примерно 20% липидных молекул; концентрация соли в объеме раствора равна 100 мМ С * А" или 9 мМ CJ+ А2". Отметим, что вблизи поверхности мембраны концентрация катионов увеличивается, а анионов — уменьшается. Концентрация А2" около мембраны очень мала и поэтому иа рисунке ие указана.

Взаимодействие иизкомолекулярных соединений с мембранами 315

где С(дг) и if(x) — концентрация иона и электрический потенциал на расстоянии дг от поверхности мембраны, С(со) — концентрация иона на бесконечном расстоянии от поверхности (концентрация в объеме), Z— валентность иона (+2, +1, -1 и т. д.), F— постоянная Фарадея. Потенциал 60 мВ при 25 °С соответствует примерно десятикратному изменению концентрации иона. Отметим еще раз, что значительное влияние на концентрационный профиль оказывает входящий в показатель экспоненты заряд иона Z.

С влиянием поверхностного потенциала связывают целый ряд самых разнообразных наблюдаемых в эксперименте эффектов. Можно считать экспериментально доказанным, что под влиянием поверхностного мембранного потенциала % концентрация ионов в околомембранном слое изменяется в соответствии с теорией Гюи—Чапмена. Это касается протонов, ионов металлов и органических ионов.

Локальное значение рН на поверхности мембраны

Концентрация ионов вблизи отрицательно заряженной поверхности мембраны выше, чем концентрация в объеме, которую измеряют с помощью рН-метра. Поэтому кажущееся значение рКл любой группы на поверхности отличается от истинного рКл. Это касается, в частности, и титруемых групп самих фосфолипидов [1471]. На рис. 7.8 приведены кривые титрования карбоксильных групп

1,0

J0'5

г г

* 5

¦ * S 8

г

oWMMNaCl •100мм NaCl

ii

3 4 5 6 7

рН раствора

Рис. 7.8. Зависимость доли депротоиированиых карбоксильных групп фосфатидилсерина (/„о-) от значения рН в объеме (экспериментальные данные) [1471]. Результаты получены с использованием липосом, содержащих 14 мол.% фосфатидилсерина и 86 мол.% фосфатидилхолииа. Кажущиеся значения рАГ, для везикул в 10 мМ и 100 мМ NaCl равны 4,7 и 3,9 соответственно. Истинное значение рК, равно 3,6, а влияние соли связано исключительно с увеличением локальной концентрации протонов иа поверхности мембраны при низкой иоииой силе

316 Глава 7

фосфатидилсерина, включенного в фосфатидилхолиновые везикулы. Кажущееся рКл составляет 4,7 при 10 мМ NaCl и 3,9 при 100 мМ NaCl. Это различие обусловлено не изменением истинного значения рКл этой группы, а увеличением концентрации Н + на поверхности мембраны при низкой ионной силе из-за увеличения if о- Истинное значение рКа по оценкам должно составлять 3,6, а зависимость рКл от концентрации ионов очень хорошо описывается теорией Гюи— Чапмена. Локальное значение рН вычисляли по уравнению (7.18), приняв дг = 0. Близкие результаты были получены с использованием помещенных на поверхность мембраны рН-индикаторов [1502]. Было показано, что значение локального околомембранного рН отличается от рН в объеме на величину, предсказываемую теорией Гюи—Чапмена.

Дополнение 7.1. Истинное и кажущееся значения

рКа группы на поверхности мембраны

Константа диссоциации рКл для протонирования группы (А") на поверхности мембраны определяется следующим образом:

„ _ [А " ][Н + ]поверхн _ [А" ][Н + U^e~ ™°/яг

Кл--[НА]---[НА] ' (7Л9)

- log КЛ = -log-т]-+ , (7.20)

рА'а(ист) = рА'а(каж) + 2 шкг » (7-21)

„ , ч [А ][Н ]объемн

где А^а(каж) =-—-=-. (7.22)

[НА]

Связывание ионов металлов [953]

Физиологическая значимость взаимодействия фосфолипидов с ионами металлов, в частности с Са2+, не вызывает сомнений, и таким взаимодействиям было посвящено значительное число исследований. Для ответа на вопрос о том, как ионы металлов связываются с фосфолипидным бислоем и изменяют структуру мембраны, был привлечен целый ряд экспериментальных методов, в частности калориметрия, рамановская и инфракрасная спектроскопия, дифракция нейтронов и рентгеновских лучей, 31Р-ЯМР и 2Н-ЯМР. В

Взаимодействие низкомолекулярных соединений с мембранами 317

табл. 7.2 приведены истинные константы диссоциации для некоторых катионов металлов, связанных с кислыми или цвиттерионными липидами. Некоторые из этих величин получали, регистрируя изменение поверхностного потенциала при связывании ионов металлов с фосфолипидными везикулами. Связывание катионов приводит к уменьшению плотности отрицательных зарядов в случае кислых фосфолипидов либо к увеличению плотности положительных зарядов в случае везикул из цвиттерионных липидов. И в той и в другой системах для анализа данных применима теория Гюи—Чапмена. Истинные константы связывания рассчитывали, исходя из концентрации свободных ионов вблизи поверхности мембраны, которая в свою очередь зависит от поверхностного потенциала, а саму константу диссоциации определяли из уравнения, аналогичного (7.19). Здесь стоит остановиться на нескольких моментах.

1. Одновалентные ионы, например натрий, действительно свя-зываюется с кислыми фосфолипидами, но с низким сродством.

2. Истинное сродство Са2+ к поверхности цвиттерионных фосфолипидных везикул близко или чуть меньше, чем к поверхности кислых фосфолипидов [27]. Более сильное связывание Са2+ с кислыми фосфолипидами обусловлено не ббльшим сродством к ним Са2 +, а скорее всего электростатическим эффектом более высокой плотности отрицательных зарядов, приводящим к возрастанию локальной концентрации Са2+ на поверхности [894, 895].

3. Связывание как одно- [269], так и двухвалентных [122, 12] катионов, по-видимому, почти не влияет на конформацию полярных

Таблица 7.2. Истинные константы диссоциации комплексов катионов металлов с некоторыми фосфолипидами0

Фосфолипид Катион

Са2 + , мМ Mg2*, мМ Na, M

Фосфатиднлхолин 72—333 500 _

Фосфатидилэта-

ноламин 333 500 —

Фосфатидил-

глицерол 50—118 167 1,4

Фосфатидилсерин 83 130 1,6

Кардиолипин 65 — 1,3

" Данные взяты нз работ [953, 27, 376, 894, 895]. Условия измерений во всех случаях были одинаковыми.

318 Глава 7

головок фосфолипидов, по крайней мере для фосфатидилхолина и фосфатидилглицерола. При связывании с фосфатидилсерином наблюдается иммобилизация карбоксильных групп [340].

4. Обычно Са2+ связывается с фосфолипидами в стехиометрии 1:1 [47], хотя в случае фосфатидилхолина один ион Са2+ связывается с двумя молекулами липида [27]. По-видимому, образуется и комплекс со стехиометрией 1:2, когда в результате связывания металла происходит агрегация мембран; при этом двухвалентный катион может служить мостиком между двумя плотно прижатыми поверхностями мембраны [953].

5. Связывание Са2* может приводить к изменению физического состояния липида [1354]. Например, связывание Са2+ с фосфатидилсер