ином или фосфатидной кислотой может сопровождаться переходом бислоя в фазу геля [602, 175], а при взаимодействии с кар-диолипином стабилизируется гексагональная фаза. Если везикулы состоят из смеси кислых и цвиттерионных липидов, то связывание с Са2+ вызывает латеральное разделение фаз [538]; при этом могут образовываться обширные домены в однослойных везикулах [607].

6. Свои преимущества дает связывание фосфолипидов с Мп2 + , поскольку этот парамагнитный ион изменяет спектр 31Р-ЯМР. Эти изменения зависят от локальной концентрации Мп2+ и, следовательно, могут использоваться для измерения поверхностного потенциала [948].

7. С поверхностью кислых бислоев прочно связываются также поликатионы, например поли-(1^лизин) [304] или гентамицин [220].

Дзета-потенциал и электрокинетические явления

Если заряженные везикулы поместить в электрическое поле, то они будут перемещаться по направлению к электроду, заряд которого противоположен по знаку заряду везикул. Электрофоретиче-ская подвижность везикул определяется так называемым дзета-потеициалом [952], который равен электрическому потенциалу между объемом раствора и так называемой плоскостью Гельмгольца, параллельной плоскости мембраны. Эта плоскость отделяет плотную часть двойного электрического слоя, которая перемещается в электрическом поле вместе с мембраной и находится на расстоянии около 2 А от заряженной поверхности везикулы. Таким образом, величина дзета-потенциала меньше, чем величина поверхностного потенциала (см., например, рис.'7.5), и связана с поверхностным потенциалом соотношением, определяемым теорией Гюи—-Чапмена. Измерение дзета-потенциала лежит в основе одного из стандартных методов оценки поверхностного потенциала и может использоваться для изучения связывания ионов с поверхностью фосфолипидных везикул [954]. На электрофоретическую подвижность влияет также

Взаимодействие низкомолекулярных соединений с мембранами 319

наличие выступающих над поверхностью бислоя заряженных нели-пидных мембранных компонентов, например белков или ганглиозидов [948], и с помощью электрокинетических методов можно получить определенную информацию о распределении зарядов вблизи поверхности везикул.

Связывание гидрофобных ионов и мембранных зондов

Наличие поверхностного потенциала может повлиять на связывание с поверхностью мембраны гидрофобных ионов и амфифильных мембранных зондов. Это позволяет использовать некоторые зонды в качестве индикаторов поверхностного потенциала. На рис. 7.9 приведены структурные формулы некоторых зондов. Для всех этих соединений интенсивность спектрального сигнала можно соотнести с количеством связанного с мембраной зонда и, следовательно, с величиной поверхностного потенциала. Такие зонды применяли для изучения многих заряженных фосфолипидных везикул

к.Гидрофобные ионы

Тетра фенил борон {Т<РБ~) Гетра фенилфосфоний {ТФФ*

6. Зонды, чувствительные н поверхностному потенциалу

•^3) CHj-N-lCHjlaCH.,

9

Colo) t

О

АНС {\-анилиночафталин- N,N - Дцметил - Н-нонил-

Ь- сульфонат) N- темнойламмонийбромид

В.Зондь' чувствительные н трансмемврамн'ому потенциалу

^ - , dil-ANEPPS

Алнилтриарилфосфонии ни троне иды гстиральный, зонд)

-О о

0нсон0Л\Г\ ,„ 4iS-C3-_(5)

— \Цианиновыи нраситель)

Рис. 7.9. Структурные формулы некоторых зондов, используемых при изучении электрических эффектов в мембранах (подробности см. в тексте и в цитируемой литературе).

320 Глава 7

Рис. 7.10. Траисмембраиные профили потенциальной энергии, иллюстрирующие влияние поверхностного заряда на трансмембранный потенциал. В вариантах А и Б дипольный потенциал не учитывался. А. Плотности отрицательного заряда на обеих поверхностях бислоя одинаковы, идентичны и поверхностные потенциалы {ф,, фг) по обе стороны мембраны, при этом траисмембранный потенциал равен нулю. Б. Одна сторона мембраны несет значительный поверхностный заряд, а другая не заряжена. В этом случае между двумя поверхностями бислоя возникает разность потенциалов, однако разность потенциалов между разделяемыми мембраной объемами раствора равна нулю. В. Одна сторона мембраны несет отрицательный заряд, а другая ие заряжена; в этом случае возникает трансмембраииая разность потенциалов. В этом варианте схема учитывает также и потенциал диполей внутри бислоя. Видно, что потенциал внутри мембраны более положительный, а близ границ раздела с обеих сторон создаются два локальных минимума энергии для анионов. ДзУ — трансмембранный потенциал, if, и зУг — поверхностные потенциалы, ДФ — разность потенциалов между поверхностями бислоя.

[948, 1409, 176]. Исследование с их помощью биомембран более проблематично, поскольку спектральные характеристики зонда могут зависеть не только от поверхностного потенциала, но и от рН или трансмембранного потенциала, что сильно затрудняет интерпретацию наблюдаемых спектральных изменений. В качестве примера можно привести связывание с митохондриями АНС (рис. 7.9,

Взаимодействие низкомолекуляриых соединений с мембранами 321

[1228]) и изменение спектральных характеристик нейтрального красного при связывании с субмитохондриальными частицами [309].

На рис. 7.10, А представлен профиль электрического потенциала для мембраны, обе поверхности которой отрицательно заряжены. При наличии на мембране поверхностного потенциала увеличивается концентрация в этой мембране таких гидрофобных катионов, как ТФФ+ (рис. 7.9) или комплекс К +-валиномицин (рис. 7.12). Это связано с тем, что локальная концентрация ионов вблизи поверхности мембраны больше, чем их концентрация в объеме. Напомним, что коэффициент проницаемости может быть представлен в виде произведения коэффициента распределения /3 на константу скорости перемещения иона через мембрану к [уравнение (7.12)], поэтому из-за большой величины /3 проницаемость отрицательно заряженной мембраны для гидрофобных катионов будет выше, чем незаряженной. Зависимость проводимости мембраны от поверхностного заряда удовлетворительно описывается уравнением Гюи—Чапмена для поверхностного потенциала [952].

Заметим, что потенциал внутренних диполей может влиять как на связывание гидрофобных ионов с поверхностью бислоя, так и на константы скорости трансмембранного транспорта (разд. 7.3.2, табл. 7.1), в то время как эффект симметричного поверхностного потенциала на проницаемость обусловлен исключительно его влиянием на коэффициент распределения. В случае асимметричного распределения поверхностных зарядов ситуация усложняется (рис. 7.10, Б). Как уже отмечалось в гл. 4, подобное асимметричное распределение липидов — явление отнюдь не редкое. В этом случае существующий на мембране градиент потенциала будет затруднять перенос катионов из водной фазы 1 в фазу 2 и облегчать перенос катионов в противоположном направлении. В следующем разделе мы рассмотрим, какой вклад вносит трансмембранный потенциал в общий профиль электрической Энергии мембраны.

7.4. Трансмембранный потенциал

Трансмембранный потенциал по определению есть разность электрических потенциалов между двумя водными фазами, разделенными мембраной. Связь между трансмембранным потенциалом (Д*) и поверхностными потенциалами *i и ¦г графически представлена на рис. 7.10, А Из схемы видно, что разность потенциалов между двумя поверхностями мембраны ДФ может отличаться от Д* из-за асимметричного распределения заряда между двумя поверхностями бислоя. Любая находящаяся внутри мембраны заряженная группа будет перемещаться в поле с потенциалом ДФ. Д* называют также потенциалом покоя, и именно эту величину, если удается, измеряют парой электродов.

322 Глава 7

[Ма+]--Щ|Щ-:-»[Ма*]г

Диффузия (равновесие)

СГ

насос

Пассивный потоп -мя+ пР°тиво-3 ионов

Стационарный поток

Ионный насос

Рис. 7.11. Схема, иллюстрирующая три способа генерации трансмембраниого потенциала. In vivo диффузия ионов через биомембраны осуществляется с участием белков-переносчиков. А. Если мембрана проницаема только для одиого-едннствеииого иона, то возникает траисмембранный потенциал, величину которого можно найти из уравнения Нериста. Б. Стационарный поток нонов также может привести к образованию трансмембранного потенциала, величина которого определяется из уравнения Голь-дмана—Ходжкина—Каца. В. Ионы через мембрану могут транспортироваться с помощью эиергозависнмого ионного насоса, но одновременно с этим для поддержания суммарной электронейтральиости через мембрану должны перемещаться другие ионы. Если диффузия противоиоиов достаточно быстрая (проницаемость мембраны для них высока), то разделения зарядов и образования трансмембранного потенциала в результате работы ионного насоса наблюдаться не будет.

Создать трансмембранный потенциал можно несколькими способами. Схематически они изображены на рис. 7.11.

1. Равновесные условия. Если мембрана проницаема для какого-то определенного иона, например Na + , и непроницаема для других, то на ней может возникнуть диффузионный потенциал, пропорциональный логарифму отношения концентраций проникающего иона по одну и другую стороны мембраны. Диффузия иона через мембрану сопровождается трансмембранным разделением зарядов, и создаваемая при этом разность потенциалов препятствует дальнейшей диффузии. Заряд, который нужно переместить через мембрану для создания на ней данного значения Aif, можно вычислить исходя из емкости мембраны [уравнение (7.15)]. Для создания Д* = 100 мВ нужно перенести примерно один заряд на 250 молекул фосфолипида. Ясно, что поверхностная плотность заряда при этом изменится крайне незначительно.

В равновесии Д* определяется уравнением Нернста:

= -ъ^^^к- (723)

Это же уравнение следует использовать в случае переноса иона с валентностью Z (для Na+ Z = 1). Проницаемость биомембран для ионов связана с работой специфических ионных каналов (см. сле-

Взаимодействие низкомолекулярных соединений с мембранами 323

дующую главу). Ее можно искусственно увеличить с помощью специфических переносчиков ионов или ионофоров, например К + -валиномицина.

2. Стационарный диффузионный ионный ток [633]. Если мембрана проницаема дял нескольких ионов, то все они будут перемещаться через нее. При этом в стационарных условиях из-за различий в коэффициентах проницаемости для разных ионов может возникнуть трансмембранная разность потенциалов. Иными словами, разделение зарядов на мембране в такой ситуации будет связано с тем, что одни ионы диффундируют через мембрану быстрее других. Уравнение, описывающее данную ситуацию, называется уравнением Гольдмана—Ходжкина—Каца и для случая двух ионов (Na + и О ~) имеет следующий вид:

Д* = - -Ж_ log /^a[Na4 + />c,[Cl-b\. (724) 2.303F °g Ыа[№+Ь + Pci[Cl-]J 1 '

Перемещение ионов будет продолжаться до тех пор, пока не установится равновесие.

3. Активный перенос ионов. Трансмембранное разделение зарядов может происходить и с помощью процессов активного транспорта. Многие ферменты катализируют реакции, сопряженные с векторным переносом зарядов через бислой. В качестве примеров можно привести разнообразные АТР-зависимые ионные насосы, например Са2 + -АТРазу (разд. 8.4.1) или цитохром с-оксидазу (разд. 8.5.1), представляющую собой протонный насос. Энзимоло-гия этих систем будет кратко описана в следующей главе. Здесь мы отметим лишь, что катализируемые этими ферментами реакции являются электрогенными, т. е. сопровождаются переносом зарядов через бислой. Очевидно, в такой системе должен существовать какой-то трансмембранный нейтрализующий ионный поток. В системе, представленной на рис. 7.11, таким потоком является пассивный контртранспорт ионов Cl ~, возникающий при работе протонного насоса. Как и в случае пассивных ионных потоков, скорость потока противоиоиов будет меньше, чем скорость активного процесса, и в результате суммарный поток ионов через бислой не будет электронейтральным и на мембране возникнет разность потенциалов А*. Если проницаемость бислоя для нейтрализующих ионов сделать достаточно большой, то разделения зарядов уже не будет. На этом принципе основано использование ионофоров для устранения трансмембранного электрического потенциала, создаваемого как на биологических мембранах, так и в модельных системах.

7.4.1. ИЗМЕРЕНИЕ ТРАНСМЕМБРАННОГО ПОТЕНЦИАЛА [54]

Величину трансмембранного потенциала лучше всего измерять

324 Глава 7

с помощью двух электродов, помещенных по разные стороны мембраны. Однако этот способ применим лишь для плоских модельных мембранных систем и некоторых крупных клеток [140]. Обычно же приходится измерять потенциал на мембране либо протеоли-посом, либо клеток или органелл, например митохондрий или хлоропластов. Для этих случаев разработано несколько методов.

1. Распределение ионов в соответствии с уравнением Нернста (7.23). В систему добавляют ион, способный проникать через мембрану, и он перераспределяется между внешней средой и внутренним объемом в соответствии с уравнением Нернста. На этом принципе основано использование в качестве молекулярных зондов таких гидрофобных ионов, как ТФФ+ [1255] или 86кЬ-валиномицин. Чтобы определить трансмембранный потенциал, нужно знать концентрацию иона внутри везикулы, органеллы или клетки, что нередко превращается в серьезную проблему. Ошибки в измерении Д* могут, в частности, возникнуть, если большие количества зонда связываются с мембранами клетки или если неправильно определен внутренний объем.

2. Спин-меченные ЭПР-зонды. Для этой цели используют несколько зондов [176, 177] (см. рис. 7.9) — гидрофобных ионов, к которым ковалентно пришита парамагнитная нитроксильная группа. Концентрацию зонда, связанного с мембраной, легко определить из спектра ЭПР; при образовании на мембране потенциала зонд перераспределяется между фазами, и по изменению его концентрации в мембране можно оценить величину Д*. Изменение концентрации мембраносвязанного зонда обусловлено тем, что для внутривезику-лярного пространства отношение площади поверхности к объему гораздо больше, чем для внешнего раствора [177].

3. Оптические молекулярные зонды. Спектральные характеристики многих оптических зондов зависят от трансмембранного потенциала. Из наиболее распространенных назовем флуоресцентные производные мероцианина, оксонола и цианиновые красители [1534, 230, 54]. Все эти соединения связываются с мембраной, и, по-видимому, в основе их реакции на изменения трансмембранного потенциала может лежать несколько механизмов [1511]. Чаще всего взаимодействие электрического диполя, каким является зонд, с электрическим полем приводит к изменению ориентации диполя в бислое. В ряде случаев изменение степени агрегации зонда в бислое влечет за собой изменение квантового выхода флуоресценции. Большинство зондов применяют для определения трансмембранного потенциала, имеющего знак минус внутри везикулы, однако некоторые красители, например оксонолы, используются при обратной полярности потенциала [782].

К зондам другого типа, спектр поглощения которых чувствителен к трансмембранному потенциалу, относятся соединения сти-

Взаимодействие низкомолекулярных соединений с мембранами 325

рольной природы, образующие в мембране конъюгированные структур