переносчик глюкозы из клеток гепатомы человека [1027] и из клеток мозга крысы [100]. Очищенный переносчик из эритроцитов представляет собой гликопротеин с кажущейся мол. массой 55 000. По-видимому, в мембране он находится в виде димера. Если судить по данным об аминокислотной последовательности, то переносчик должен содержать 12 трансмембранных а-спиральных участков, однако экспериментальные данные не дают окончательного ответа на этот вопрос [1027, 202, 287]. Очищенный переносчик удалось встроить в фосфолипидные везикулы, при этом оказалось, что он ориентирован асимметрично ([202]; см. также гл. 6).

Как и при исследовании канальных белков, очень важную роль сыграли опыты с использованием специфических ингибиторов, обладающих высоким сродством к переносчику. В число этих ингибиторов входят цитохалазин В и флоретин, которые связываются с

Поры, каналы и переносчики 373

переносчиком со стехиометрией 1:1 [790]. Одни ингибиторы (цитохалазин В) связываются с переносчиком только в том случае, если они находятся с цитоплазматической стороны мембраны, другие специфически связываются с наружной стороны мембраны (флоретин) [790]. В работе [642] было показано, что места связывания двух указанных ингибиторов находятся вблизи С-конца полипептида.

Большинство (но не все [615]) кинетических данных и данных по связыванию согласуются с простой моделью четырех состояний (рис. 8.2), в которой предполагается, что существует единственное место связывания D-глюкозы, находящееся внутри канала. Для измерения индивидуальных констант скоростей использовали ЯМР [1549] и метод остановленной струи [42]. Конформация загруженного канала изменяется с константой скорости 2000 с~', которая приблизительно в семь раз выше аналогичной константы для незагруженного канала (300с-1 при 23 °С). Следовательно, обмен глюкозы происходит с большей скоростью, чем транспорт как таковой, для осуществления которого незагруженный переносчик должен возвратиться через мембрану. Природа конформационного изменения неизвестна, хотя оно было зарегистрировано при помощи инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье [28] и, как предполагают, включает скольжение а-спиралей друг относительно друга [1549].

Между переносчиком глюкозы из клеток млекопитающих и некоторыми транспортными системами бактерий наблюдается значительная гомология [906, 290]. Удивительно, что такая гомология наблюдается также между переносчиком глюкозы и белками, осуществляющими симпорт Н + -арабинозы и Н +-ксилозы. Эти сим-портеры, как и описываемая ниже система транспорта Н +-лактозы, используют для аккумуляции указанных сахаров электрохимический протонный градиент. Переносчик глюкозы из мембраны эритроцитов не транспортирует Н+ и не способен к транспорту против градиента глюкозы. Очень важными представляются работы по изучению взаимосвязи структуры белкового комплекса и механизма его работы.

8.3.2. ЛАКТОЗОПЕРМЕАЗА ИЗ Е. соН [1608, 717, 716]

Этот комплекс изучен наиболее полно из всех симпортных белков. Он кодируется /ясУ-геном, который является частью lac-оперона, и его часто называют lac-пермеазой. Ген lacY был клонирован и секвенирован, и из штамма-сверхпродуцента был выделен белок — продукт этого гена. Пермеазу можно изучать в цитоплазматических мембранных везикулах (кабакосомах), в интактных клетках или в реконструированных протеолипосомах. Судя по дан-

374 Глава 8

Ml

л..

Внутри \

7 »*«„

*> • ..»

3

4° 11

4

I NN О 6

TV"

М | .к®

8 2

Снаружи ""в"'

12*

(загруженный) н* E,S . •и- E0S

Е, Е„

(незагруженный)

Рис. 8.11. Аминокислотная последовательность Н * -лактоэопермеазы из Е. coli (А) и кинетическая схема, использующаяся для анализа работы этой системы (Б) [716]. Аминокислотные остатки, заключенные в кружки, определяют субстратную специфичность (специфичность связывания сахара), а остатки, заключенные в квадратики, участвуют в сопряжении протоиироваиия и транспорта лактозы. Стрелками отмечены участки, которые, по данным эксперимента, выступают в цитоплазму. Е и Ео — коиформации пермеазы, в которых места связывания субстрата обращены к цитоплазме или к периплазме соответственно.

ным об аминокислотной последовательности, белок имеет мол. массу 46 500, хотя результаты электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН дают другую величину (гл. 3). Почти не вызывает сомнения, что функциональной единицей в мембране является мономер [253], хотя некоторые данные свидетельствуют о существовании димерной формы пермеазы in vivo [1608 , 716].

На основании данных об аминокислотной последовательности лактоэопермеазы были построена модели, согласно которым этот белок имеет 12 или 14 трансмембранных а-спиралей [716, 1525]. Это в основном согласуется со спектроскопическими данными, свидетельствующими о высоком содержании а-спиралей, и немногочисленными топологическими данными. На рис. 8.11 представлена модель, построенная Кабаком, с указанием сегментов, которые, согласно экспериментальным данным, являются цито- или периплаз-матическими [1314].

Поры, каналы и переносчики 375

Кинетику транспорта с помощью пермеазы изучали, используя подходы, описанные в разд. 8.1.3: 1) выведение лактозы по градиенту или транспорт в везикулы (нуль с транс-стороны); 2) активный транспорт лактозы против градиента концентрации, сопряженный с протонным электрохимическим градиентом; 3) равновесный обмен; 4) противоток (бесконечность с j/ыс-стороны). Для анализа данных можно использовать кинетическую схему, представленную на рис. 8.11 [1607], хотя между двумя различными группами ученых имеются существенные разногласия по этому поводу [1607]. Однако основные особенности транспорта с участием лактоэопермеазы представляются достаточно ясными.

1. Пермеаза имеет одно или более мест связывания для протона и одно — для лактозы. Эти места бывают поочередно обращены к периплазматической и цитоплазматической сторонам мембаны, и соответствующий коиформациониый переход является лимитирующей стадией процесса [1607]. Максимальная скорость транспорта равна 25—50 с" 1. При наличии трансмембранного протонного электрохимического потенциала (ДДН +) Км для лактозы составляет - 80 мкМ; место связывания протона, возможно, характеризуется высоким рКл, поэтому большую часть времени протонировано. При ДДН. = 0 значение Км для лактозы гораздо выше — 15—20 мМ.

2. Транспорт лактозы обязательно сопровождается транспортом Н+ со стехиометрией 1:1.

3. Конечным результатом транспорта является перенос через бислой положительного заряда. Следовательно, важную роль в установлении равновесия и скорости транспорта играют трансмембранный электрический потенциал (Д?) и разность протонного химического потенциала (ДрН) [1608, 716] (см. также разд. 7.4.2).

Дополнение 8.4. Генетические подходы

и сайт-специфический мутагенез: важные методы изучения лактоэопермеазы

Наиболее ценные данные при изучении лактоэопермеазы были получены с помощью генетических методов [717, 151, 970]. Эти работы начали проводить сравнительно недавно, но уже ясно, что такого рода подходы помогут получить важные результаты при изучении как этой, так и других транспортных систем. С помощью направленного мутагенеза было показано, что при замене аланина-177 или тирозииа-236 данная пермеаза может переносить мальтозу. Эти сайты, отмеченные на рис. 8.11 кружками, могут участвовать в связывании сахара.

376 Глава 8

Кабак и его коллеги использовали сайт-специфический мутагенез для изучения механизма функционирования пермеазы. Было показано, что замена многих аминокислот не оказывает заметного влияния на кинетику транспорта. Это означает, что данные аминокислоты не принимают прямого участия в транспорте; более того — их замена не приводит к «глобальным» конформационным изменениям белкового комплекса и не препятствует нормальной организации комплекса в мембране.

Были выделены три мутантные формы, неспособные катализировать определение стадии транспорта [717, 790]. Особенно существенны для нормального транспорта гистидЬн-322, глутамат-325 и аргинин-302; возможно, эти аминокислоты участвуют в переносе заряда внутри мембраны. Было высказано предположение, что они образуют некую связанную водородными связями группу между спиралями 9 и 10 (рис. 8.11). Пермеаза, в которой глутамат-325 заменен на аланин, не может катализировать активный транспорт или выведение лактозы, но способна осуществлять нормальный обмен лактозы (разд. 8.1.3). Следовательно, нагруженная форма переносчика может претерпевать нормальные конформационные изменения, блокируется же какая-то другая стадия полного цикла, возможно депротонирование пермеазы. Можно надеяться, что именно с помощью такого рода экспериментов удастся понять механизм работы данного переносчика. При этом очевидно, что в интерпретации результатов ключевую роль могло бы сыграть установление трехмерной структуры фермента.

Как у Е. coli, так и у высших организмов имеются другие системы симпорта сахара и катионов [1608]. Однако лактозопермеаза не гомологична ни переносчикам Н +-ксилозы или Н + -арабинозы, ни переносчику глюкозы млекопитающих, описанному в предыдущем разделе. Никакой гомологии не было обнаружено также между лак-тозопермеазой и мелибиозопермеазой из Е. coli [1608, 717]. Последняя использует в качестве движущей силы для накопления мелибио-зы симпорт не только Н + , но также и Na + . Способность использовать Na +, по всей вероятности, исключает механизмы с перескакиванием протона по сети водородных связей в пронизывающей мембрану части переносчика. Известен также некий переносчик Na +-глюкозы, который катализирует накопление глюкозы в клетках щеточной каемки кишечника [1608, 1135, 1610].

Поры, каналы и переносчики 377

8.3.3. БЕЛОК ПОЛОСЫ 3 — АНИОННЫЙ ПЕРЕНОСЧИК ИЗ МЕМБРАНЫ ЭРИТРОЦИТОВ [703, 876]

На долю белка полосы 3 приходится около 25% общего количества мембранных белков эритроцита человека; сходные белки присутствуют также в неэритроидных клетках [322]. Этот белок выполняет несколько функций, причем их можно соотнести с двумя основными доменами белковой молекулы. N-концевая часть (41 000 Да) является гидрофильной и локализована с цитоплазматической стороны эритроцитарной мембраны. Она содержит места связывания для компонентов цитоскелета (анкирина), а также для ферментов гликолиза и гемоглобина ([876]; см. также разд. 4.3.4 и 6.7.2). Этот домен можно удалить путем протеолиза, не затронув С-концевого домена (52 000 Да), который остается связанным с мембраной и опосредует С1"/НСОэ~обмен (разд. 8.1.1), а также образует канал в мембране, через который может проникать вода (разд. 7.2.1). Внецитоплазматический компонент этой части белка содержит также углеводные антигенные детерминанты нескольких систем групп крови. В мембране белок полосы 3 находится в форме димера или тетрамера.

Было проведено клонирование и секвенирование участка кДНК, кодирующего белок полосы 3 из эритроцитов мыши [774]. Эти данные послужили основой для построения модели белка полосы 3 [775, 774]. Было высказано предположение, что он имеет 12 трансмембранных а-спиралей, при этом некоторые из них являются ам-фифильными. Экспериментальные данные, подтверждающие эту гипотезу, получены только для нескольких участков полипептида и основаны главным образом на результатах протеолиза и локализации связанных углеводов.

Обширные кинетические исследования согласуются с моделью с чередованием конформации и одним местом связывания (см. рис. 8.2). Однако скорость равновесного анионного обмена с помощью переносчика по меньшей мере в 104 раз превышает скорость транспорта как такового. Следовательно, незагруженный переносчик не претерпевает быстрых конформационных превращений, необходимых для того, чтобы анион мог связаться с мембраной. По данным ЯМР с использованием 35С1, у переносчика имеется единственное место связывания, и оно может быть обращено как внутрь, так и наружу [408, 411]. Результаты опытов с использованием игнибиторов транспорта [412, 410, 409] тоже свидетельствуют о том, что в канале имеется единственное место связывания аниона, локализованное где-то в середине канала. При этом предполагается, что переход этого места связывания с одной стороны мембраны на другую блокируется неким «скользящим барьером», который перемещается вдоль канала в результате конформационных изменений. Лимитирующей стадией является конформационный переход

378 Глава 8

нагруженного переносчика, но происходит он достаточно быстро, с частотой 105 с ~1 при 37 °С. По-видимому, такая высокая скорость предотвращает значительные конформационные изменения в белке. Природа этого конформационного перехода и точная структура канала экспериментально не определены.

Конформационный переход загруженного переносчика, лимитирующий весь транспортный процесс, лишь в очень малой степени зависит от мембранного потенциала. Это согласуется с таким кон-формационным переходом, в результате которого через мембрану перемещается 0,1 связанного с белком заряда [556]. Если этот переход сопряжен с перемещением анионного субстрата, то он должен сопровождаться переносом противоиона, например заряженной аминокислотной группы. В отличие от этого потенциалзависимое конформационное изменение, индуцирующее открывание натриевого канала, приводит к результирующему перемещению через мембрану шести связанных с белком зарядов [193].

8.3.4. ГРУППА МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ПЕРЕНОСЧИКОВ [45]

Гомологичность некоторых транспортных белков внутренней митохондриальной мембраны свидетельствует об их близком родстве: по всей вероятности, они произошли от общего предка в результате дивергентной эволюции (табл. 8.2). Имеются по меньшей мере три представителя этой группы: 1) ADP/ATP-транслоказа; 2) переносчик фосфата [1260] и 3) разобщающий белок. В структуре этих белков имеется много общего, и тем не менее они существенно различаются по субстратной специфичности. ADP/ATP-транслоказа катализирует транспорт ADP и АТР через бислой. При физиологических условиях АТР транспортируется из митохондрий, a ADP переносится в матрикс. Механизм этого процесса, по-видимому, аналогичен таковому для белка полосы 3, за исключением того, что АТР несет на один отрицательный заряд больше, чем ADP, и поэтому обмен зависит от трансмембранного электрического потенциала на митохондриальной мембране. Переносчик фосфата осуществляет одновременно и симпорт Н +, и, во-видимому, механизм его работы сходен с описанным ранее механизмом для Н + -лактоэопермеазы из Е. coli (разд. 8.3.2). Этот белок катализирует транспорт фосфата внутрь митохондрий. Благодаря симпорту Н+ процесс в целом является электронейтральным и не зависит от трансмембранного потенциала. Разобщающий белок [420] был обнаружен в митохондриях из клеток бурого жира млекопитающих; его функция заключается в диссипации протонного электрохимического градиента, создаваемого при функционировании дыхательной цепи, в результате чего генерируется тепло. Разобщающий белок может так-

Поры, каналы и переносчики 379

же катализировать транспорт анионов, например С1" , так что, может быть, на самом деле он катализирует транспорт ОН ~, который невозможно экспериментально отличить о