и-ческий рецептор

Мускариновый холинерги-ческий рецептор

А|-аденози-новый рецептор

D2-дофаминовый рецептор

Опиатный рецептор

Аденилатциклаза

Родопсин

cGMP-специ-фичная фос-фодиэстераза

Фосфолипаза А2

Опиатный рецептор (мозг)

Потенциал-зависимый Са2 +-канал

Мускариновый холинерги-ческий рецептор

ai-Адренерги-ческий рецептор

Вазопрессин о-вый рецептор

Ангиотензиновый рецептор

IgE-рецеп-тор с высоким сродством

Фосфатидил-нозитол-специфичная фосфолипаза С

Мускариновый холинерги-

Дофаминовый рецептор

Гистаминовый рецептор

-канал (?)

Функция

Мол. масса субъединиц

Чувствительность к токсину

Стимуляция

45000 и 52000 35000 и 36000 8000

Холерный токсин

Ингибирование

41000

35000 и

36000

8000

Коклюшный токсин

Стимуляция

39000 36000 8000

Коклюшный и холерный токсины

Закрывание канала

39000

35000 и

36000

8000

Коклюшный токсин(?)

Стимуляция

Неизвестна

Открывание канала

Неизвестна

" Для указанных гормонов и нейромедиаторов может существовать более одного рецептора. Этот список не является исчерпывающим. 1 Некоторые из этих выводов чисто спекулятивны, функция G0 и существование Gp и Gk пока четко не продемонстрированы. Gp, о котором здесь идет речь, не соответствует белку, выделенному из плацентарных мембран [401]. Возможно, Gk является одним из вариантов G,.

442 Глава 9

дают СТРазной активностью при отсоединении от /37-субъединич-ной пары. а-Субъединица также содержит сайт, по которому может происходить ADP-рибозилирование бактериальными экзотоксинами. Gi, G0 и Gt (трансдуцин) модифицируются коклюшным токсином, a Gs и Gt — холерным токсином. Эта ковалентная модификация блокирует фосфорилирование G-белка и служит одним из тестов на участие G-белков в качестве интермедиатов в клеточных ответах. Заметим, что модификации холерным и коклюшным токсинами оказывают существенно разные эффекты. Модификация холерным токсином приводит к непрерывной активации Gs в присутствии АТР, а коклюшный разъединяет Gi, G0, G( и рецептор, необходимый для их активации.

G-белки могут стимулироваться в отсутствие гормона при добавлении в цитозоль негидролизуемого аналога GTP — GTP7S, который связывается а-субъединицей. Это служит вторым тестом на участие G-белков в физиологическом ответе [1400]. Стимулировать G-белок может и добавление фторида; по-видимому, при этом образуется фторалюминатный комплекс со следовыми количествами алюминия. Этот ион, A1(F)4, связывается с комплексом G-белок/ GDP и активирует его, по-видимому, так же, как аналог 7-фосфата GTP [97].

Все G-белки прочно связаны с плазматической мембраной, за исключением трансдуцина, который in vitro может легко отсоединяться от мембраны. По крайней мере в двух случаях — для Gi и G0 — было показано, что для прочного прикрепления а-субъединиц к мембране необходимо присутствие /37-пары (см. рис. 9.15) [1389]. Ни одна из субъединиц не является трансмембранным белком. Однако по меньшей мере в некоторых случаях а-субъединица аци-лирована (табл. 3.8) и может присоединяться к мембране с помощью ковалентно связанной жирной кислоты. Присоединение к рецептору гормона или нейромедиатора (или световая активация родопсина) ускоряет быстрый обмен GDP, связанного с а-субъединицей, с GTP. G-белок отсоединяется от рецептора, и в конечном счете а-субъединица отсоединяется от /37-пары. G-белок или отсоединившиеся а- либо /37-субъединицы диффундируют в плоскости мембраны или через цитоплазму к мишени(ям). Способы связывания субъединиц G-белка с мембраной и с их партнерами-мишенями или рецептором точно не известны [196]. Однако установлено, что после отсоединения а- и /37-субъединицы могут обладать разными функциями; так, в случае трансдуцина а(-субъединица стимулирует фосфодиэстеразу, а ^-субъедииицы — фосфолипазу А2 [704].

С функциональной точки зрения ключевыми пунктами рассматриваемой системы является то, что она обеспечивает амплификацию, а также ограничивает время ответа. Занятый рецептор может активировать много G-белков. Например, каждая активированная

Клеточная поверхность 443

светом молекула родопсина может активировать около 500 молекул Gi. Каждая из них активирует молекулу фосфодиэстеразы, которая за время жизни в активированном состоянии гидролизует 1000 молекул cGMP. Следовательно, амплификация достигает 106. В случае родопсиновой системы уменьшение концентрации cGMP в цитоплазме приводит к закрыванию cGMP-зависимого К +-канала, что сопровождается гиперполяризацией плазматической мембраны и генерацией нервного импульса [43]. а-Субъединица гидролизует связанный GTP за считанные секунды и затем возвращается к занятому рецептору, чтобы вновь активироваться; следовательно, контроль за продолжительностью ответа может осуществляться на уровне рецептора, и были выявлены многочисленные механизмы, с помощью которых происходит «десенсибилизация» рецепторов.

Первый G-белок (трансдуцин) был выделен из родопсинсвязан-ной системы, где он присутствует в относительном избытке. Установлено, что G-белки повсеместно используются для передачи информации о том, что рецептор занят, на специфическую внутриклеточную систему амплификации сигнала. По-видимому, в будущем будут обнаружены другие G-белки и достигнуты новые успехи в определении их специфичности, особенно в случае, когда одна клетка содержит разные G-белки.

9.7.3. ОБНОВЛЕНИЕ ФОСФАТИДИЛИНОЗИТОЛА И ВТОРЫЕ ПОСРЕДНИКИ [907, 1124, 90в, 80, 94]

Наиболее широкораспространенными мишенями G-белков являются аденилатциклаза (для Gs и Gi) и фосфолипаза С, ответственная за гидролиз фосфатидилинозитола (для Gp). Модуляция аденилатциклазы приводит к изменению внутриклеточной концентрации сАМР, который, как известно, служит вторым посредником, влияя на множество внутриклеточных процессов. Одним нз последствий увеличения содержания сАМР является, например, стимуляция сАМР-зависимой протеинкиназы (протеинкиназа А), которая в свою очередь фосфорилирует специфические белковые субстраты [239]. Клетки содержат также два типа Са2 +-зависимых протеннки-наз, активируемых соответственно Са2 +-кальмодулином и Са * вместе с диацилглицеролом и фосфатидилсерином (протеинкиназа С). Активность обеих этих кии аз регулируется вторыми посредниками, образующимися при деградации фосфатидилинозитола, которая во многих клетках инициируется путем G-белокзависимой активации специфической фосфолипазы С. Установление механизма обновления фосфатидилинозитола и физиологической роли продуктов его деградации явилось главным достижением в выяснении роли

444 Глава 9

гормонов и нейромедиаторов в осуществлении клетками их функций.

На долю фосфатидилинозитола (PI) приходится лишь 2—8% всех фосфолипидов, содержащихся в клеточных мембранах эукариот [908]. Структура его полярной головки представлена на рис. 9.16. Этот стереоизомер называют миоинозитолом, поскольку впервые он был выделен из мышц (гомогената). Небольшая часть фосфатидилинозитола фосфорилирована по положению 4 или по положениям 4 и 5. От 1 до 10% фосфатидилинозитола, присутствующего в мембране, приходится на долю фосфатидилинози-тол(4,5)-бисфосфата, обозначаемого как PIP2 или Р1(4,5)Р2. Этот компонент является, вероятно, первой мишенью для фосфатидили-нозитолспецифичной фосфолипазы С, которая активируется во многих клетках G-белком. Последующий гидролиз приводит к быстрому распаду фосфатидилинозитола в плазматической мембране и кратковременному возрастанию количества продуктов распада. Например, во время активации тромбоцитов за 90 с деградирует половина общего пула фосфатидилинозитола [908]. Продукты распада действуют как вторые посредники и участвуют во многих клеточных процессах. Исследование этой системы еще не закончено, но общая ее схема уже построена и представлена на рис. 9.16. После-' довательность событий такова.

1. Начальными продуктами гидролиза PIP2 являются диацил-глицерол и ииозитол(1 4,5)трисфосфат [1(1,4,5)Рз]. Диацилглицерол связан с мембраной, а 1(1,4,5)Рз является растворимым компонентом. Обычно жирные кислоты фосфатидилинозитола представлены стеариновой кислотой в положении 1 и арахидоновой кислотой в положении 2 глицерола. Из мозга быка были выделены две разные фосфатидилииозитолспецифичные фосфолипазы С [1266, 1204], но данные об их активации G-белком in vitro отсутствуют.

2. 1(1,4,5)Рз служит вторым посредником, и его основной функцией, по-видимому, является мобилизация Са2 + , аккумулированного в эидоплазматическом ретикулуме. Возможно, этот компонент путем прямого связывания открывает Са2 + -специфичные каналы в эидоплазматическом ретикулуме, что приводит к увеличению концентрации Са2 + в цитоплазме в несколько раз. Обычно концентрация свободного Са2+ в цитоплазме составляет 0,1 мкМ.

3. Специфическая киназа превращает некоторое количество 1(1,4,5)Рз в тетрафосфорилированный продукт 1(1,3,4,5)Р4 [657]. Образуются также другие, в том числе циклические, фосфоинозитиды, и некоторые из них тоже имеют физиологическое значение [908].

4. Одним из ферментов, регулируемых Са2 +, является фосфолипаза С, которая при низкой концентрации Са2+ использует в качестве субстрата преимущественно PIP2, но при более высокой концентрации Са 2 +, по крайней мере in vitro, использует нефосфорили-

Рис. 9.17. Структура наиболее сильнодействующего форболового диэфира (агента, ускоряющего опухолеобразование) 12-0-тетрадеканоилфорбол-13-ацетата [50]. Это соединение действует как аналог диацилглицерола, связываясь с протеинкиназой С и активируя ее.

рованиый фосфатидилинозитол. Возможно, это облегчает непосредственный быстрый гидролиз основной части фосфатидилинозитола, но так ли это — неясно [908].

5. Наиболее важным ферментом, активируемым Са2 + , является протеинкиназа С (см. разд. 6.7.1). Этот фермент локализован преимущественно в цитозоле до момента появления там диацилглицерола и Са2 +. Затем в зависимости от присутствия фосфатидилсерина он связывается с плазматической мембраной и активируется [80]. Эффекты, сходные с действием диацилглицерола, оказывают фор-боловые эфиры (рнс. 9.17), и протеинкиназу С часто рассматривают как рецептор этих соединений [50]. Одним из признаков участия протеинкиназы С и фосфоинозитидной системы в клеточном ответе на присутствие агониста является дублирование эффектов агониста путем добавления форболовых эфиров, которые непосредственно активируют протеинкиназу С [50].

В активированном состоянии протеинкиназа С является серин-и треоиинспецифичной протеинкиназой, которая фосфорилирует как специфические мишени, так и саму себя [1063]. Природа такой субстратной специфичности и физиологические последствия фосфорилирования белков точно не известны. Однако с помощью молекулярного клонирования удалось установить, что существует семейство протиеинкиназ С (например, известны три их вида, выделенные нз мозга кролика) [186]. Возможно, оии обладают разной специфичностью, как и семейство G-белков.

Механизм регуляции работы протеинкиназы С неизвестен; установлено лишь, что ганглиозиды [786] и лизосфннголипиды [587] ин-гибируют этот фермент, а кроме того, выделен его ингибитор белковой природы [892].

6. Диацилглицерол может подвергаться дальнейшей деградации под действием диацил г лицероллипазы до арахидоновой кислоты, которая окисляется до множества биологически активных метабо-

литов, называемых эйкозаноидами и включающих простаглаидины. Хотя арахидоновая кислота сама является вторым посредником [1167], неясно, насколько существен для ее образования фосфатидилинозитолспецифичный, зависимый от фосфолипазы С путь. С другой стороны, арахидоновая кислота может образовываться из множества фосфолипидов при действии фосфолипазы Аг. В нескольких типах клеток путь биосинтеза с участием фосфолипазы Аг более важен [163, 317].

Итак, суммируя сказанное выше, можно утверждать, что при функционировании рассмотренной сложной системы образуются по меньшей мере три известных вторых посредника: диацилглицерол, 1Рз и арахидоновая кислота. Каждый из них выполняет специфические функции, включая увеличение содержания внутриклеточного Са + н активацию Са2 + -зависимых протеинкиназ. Эта система распространена весьма широко, но детали механизма воздействия с ее помощью на специфические клеточные функции пока неясны.

9.7.4. ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ РЕЦЕПТОРОВ И ДЕСЕНСИБИЛИЗАЦИЯ [1340]

Физиологический ответ на действие гормона или нейромедиато-ра обычно является кратковременным даже при постоянном присутствии агониста. Это явление называется десенсибилизацией и характерно для многих систем ответа как у эукариот, так и у прокариот. Как мы уже говорили в разд. 9.6, десенсибилизация системы хемотаксиса Е. coli частично обусловлена ковалентной модификацией рецепторов путем метилирования. В животных клетках решающую роль в десенсибилизации играет фосфорилирование рецепторов.

Индуцируемая лигандом десенсибилизация может рассматриваться в двух вариантах. Гомологичная десенсибилизация происходит тогда, когда ослабляется ответ на специфический агонист, но ответ иа другие агонисты, действующие через разные рецепторы, остается без изменения. Гетерологичная десенсибилизация наблюдается в случае, когда применение одного агониста ослабляет ответ клетки на многочисленные агонисты, действующие через различные рецепторы. В обоих случаях происходит фосфорилирование в основном рецепториых белков. В этих реакциях участвуют две киназы — протеинкиназа С и сАМР-зависимая протеинкиназа, называемая также протеинкиназой А. Кроме того, рецепторы (например, родопсин и /3-адренергические рецепторы) могут модифицироваться под действием рецепторспецифичн ы х кии аз; протекают также реакции аутофосфорилирования, катализируемые теми рецепторами, которые представляют собой тирозиновые протеинкиназы.

448 Глава 9

В основе гетерологичной десенсибилизации лежит классическая регуляция по типу обратной связи. Агонисты, стимулирующие аденилатциклазы (например, простагландин Ei, действующий через /3-адреиергический рецептор), активируют протеинкииазу А, которая в свою очередь фосфорилирует рецептор и вызывает его десенсибилизацию. Например, фосфорилированный /3-адренергический рецептор обладает меньшей способностью активировать Gs-белок. Аналогичным образом агонисты, стимулирующие фосфатидилинози-тольную систему, активируют протеинкииазу С, которая фосфорилирует рецептор и ослабляет ответ. В качестве примера можно привести а!-адренергический рецептор. Не исключено также, что рецепторы, связанные с фосфатидилинозитольной системой, модулируются протеинкиназой А, стимулированной сАМР. Примером такого рода является мускариновый ацетилхолиновый рецептор [166].

Гомологичная десенсибилизация была описана для /3-адренерги-ческих рецепторов и включает фосфорилирование рецепторов с помощью рецепторспецифичной киназы. Эта киназа фосфорилирует только комплекс рецептор/агонист, в результате чего происходит интернализация фосфорилированного рецептора путем эндоцитоза. В эндоцитозных везикулах находится фосфатаза, которая отщепляет фосфатную группу(ы) и регенерирует активную форму рецептора, возвращающегося к плазматической мембране. Аналогичная киназа была описана для «светового»