гда хотят получить немембранные органеллы, такие, как рибосомы, нуклеоиды и т. д., детергенты обеспечивают мягкое лизирование клеток после нарушения целостности муреина (грамположи-тельные бактерии) или наружной мембраны (грамотри-цательные бактерии). Детергенты применяют также для того, чтобы избирательно перевести в раствор цитоплаз-матическую мембрану грамотрицательных бактерий, сохранив интактной наружную мембрану, или удалить мембранные загрязнения с рибосом, полисом и стенок грамположительных клеток.

Детергенты представляют собой амфипатические молекулы, т. е. молекулы, имеющие как гидрофильную, так и гидрофобную области; они умеренно растворяются в воде. В очень низких концентрациях детергенты образуют в воде истинный раствор. По мере возрастания концентрации молекулы детергента агрегируют с образованием мицелл, в каждой из которых гидрофильные области обращены к воде, а гидрофобные скрыты от воды внутри мицеллы. Концентрацию, при которой по мере добавления детергента к воде начинают образовываться мицеллы, называют критической концентрацией мицеллообразования (ККМ). Каждый детергент характеризуется своими ККМ, размерами и формой мицелл. Превосходный обзор Хелениуса и Симонса [3] суммирует свойства многих детергентов, применяемых для получения клеточных фракций.

Детергенты можно подразделить на три класса, различающиеся по свойствам мицелл, способности связываться с белками и способности взаимодействовать с другими растворенными веществами. К этим классам относятся ионные детергенты, неионные детергенты и соли желчных кислот. С каждым детергентом связаны свои трудности и свои преимущества при фракционировании клеток.

Ионные детергенты

К самым распространенным ионным детергентам относятся додецилсульфат натрия (лаурилсульфат натрия, ДСН), N-лаурилсаркозинат натрия (саркозил), алкил-бензосульфонаты (обычные, применяемые в домашнем хозяйстве детергенты) и соли четвертичных аминов, такие, как бромид цетилтриметиламмония (цетавлон). Ионные детергенты склонны образовывать небольшие мицеллы (с мол. массой —^10 ООО) и имеют относительно высокую ККМ (для ДСН ККМ при комнатной температуре в разведенных буферах составляет примерно 0,2%). На ККМ и растворимость ионных детергентов сильно влияют ионная сила раствора и природа присутствующих в нем противоионов. К примеру, 10%-ный раствор ДСН теряет стабильность при температуре около 17 °С, в то время как сходный раствор додецилсуль-фата в трисе стабилен при 0°С. Додецилсульфат калия растворим только при повышенных температурах, и поэтому при использовании этого детергента К+ следует исключать из всех буферов.

Такие детергенты, как ДСН, которые имеют сильно ионизированную гидрофильную группу, не подвержены влиянию изменения реакции среды в широком диапазоне рН и не осаждаются 5%-ной трихлоруксусной кислотой. Ионные детергенты сильно связываются с белками, и в случае ДСН обычно происходит разворачивание и необратимая денатурация белковых молекул. Хотя ионные детергенты можно удалить диализом, как правило, этого не делают из-за значительного связывания их с белками.

Неионные детергенты

К неионным детергентам относятся тритон Х-100, нонидет Р-40 (NP-40), твин 80 и октилглюкозид. Обычно мицеллы этих детергентов обладают большой молекулярной массой (50 000 и больше) и низкой ККМ

(0,i% и ниже), что ограничивает их применимость при гель-фильтрации или гель-электрофорезе. На свойства этих детергентов в растворе почти не влияют реакция среды и ионная сила, хотя они могут осаждаться 5%-ной трихлоруксусной кислотой. Неионные детергенты связываются только с гидрофобными белками и, как правило, не вызывают денатурации или потери биологической активности.

Соли желчных кислот

Соли желчных кислот представляют собой соли сте-риновых производных, например холат, дезоксихолат или таурохолат натрия. Из-за того что массивные стери-новые ядра плохо упаковываются, эти детергенты образуют небольшие мицеллы (часто всего из нескольких молекул), а молекулярная масса последних в отличие от других детергентов является функцией концентрации детергента. Поскольку эти детергенты — соли очень плохо растворимых кислот со значениями рК« в области 6,5—7,5, их следует использовать в щелочных диапазонах значений рН. Чтобы избежать трудностей с растворением, применяют концентрированные исходные растворы, которые готовят, растворяя в избытке NaOH соответствующую свободную кислоту. При работе с этими детергентами ионный состав, значение рН и общая концентрация детергента должны поддерживаться на постоянном уровне.

Проблемы,

возникающие при использовании детергентов

Поскольку большинство детергентов используется в концентрациях, довольно сильно превосходящих ККМ, и поскольку действие детергентов обусловлено образованием смешанных мицелл с липидами или связыванием с белками, отношения детергент: белок или детергент : липид значительно важнее истинной концентрации детергента. Как правило, достаточный избыток детергента обеспечивается при соотношении 2—4 мг детергента к 1 мг белка. Например, если для солюбилизации мембран используется 2%-ный тритон Х-100, концентрация белка в пробе должна быть не больше 5—10 мг/мл.

Тритон Х-100, один из самых ценных неионных детергентов, создает трудности при измерениях количества белка, поскольку он содержит ароматический остаток, препятствующий измерению поглощения при 280 нм, а в пробах с участием химических реагентов образует мутный осадок. Мы обычно преодолеваем эту трудность с помощью мечения культуры небольшим количеством 3Н-лейцина. Если метка вводится в минимальную или синтетическую солевую среду, следует позаботиться о том, чтобы добавить туда достаточное количество немеченого лейцина, обеспечив тем самым постоянное в течение всего периода роста включение изотопа из расчета на 1 мг белка. Для Е. colt достаточно добавить в качестве носителя 20—40 мкг немеченого лейцина, чтобы достичь равномерного включения метки. Когда ввести метку по каким-либо соображениям невозможно, содержание белка измеряют и в присутствии тритона Х-100 модифицированным методом Лоури, описанным в работе [11], в соответствии с которым к пробе добавляют избыток ДСН. Последний образует стабильные смешанные мицеллы с тритоном, не мешающие измерениям.

Тритон Х-100 и другие сходные с ним неионные детергенты растворяются в водно-спиртовых смесях, а белки из таких смесей можно выделить осаждением в этаноле. Пробу помещают на лед и к ней добавляют при перемешивании 2 объема охлажденного на льду абсолютного этанола. Смесь выдерживают в течение ночи в морозильнике и собирают осадок белка центрифугированием. Для эффективного осаждения требуется концентрация белка не меньше 0,2 мг/мл. Разбавленные растворы белка концентрируют в аппарате для ультрафильтрации фирмы Amicon с помощью фильтра РМ-30. Правда, следует иметь в виду, что при этом концентрируются также и мицеллы детергента.

ДСН удаляют из проб ацетоновым осаждением. Шесть объемов безводного ацетона добавляют к пробе при комнатной температуре, а выпавший осадок отделяют центрифугированием. Осадок промывают несколько раз водно-ацетоновой смесью (6*1). Так как осадок часто оказывается воскообразным и с ним трудно работать, мы обычно диспергируем его в воде гомогенизатором Поттера, а затем лиофилизуем.

5.2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ДСН представляет собой самый простой и самый эффективный способ выявления набора полипептидов, присутствующих в субклеточных фракциях. Этот метод сейчас во многих случаях заменяет ферментативный и химический анализ при установлении чистоты и гомогенности субклеточных фракций.

Для электрофореза в полиакриламидном геле используются разнообразные выпускаемые промышленностью и самодельные приборы. Мы предпочитаем те приборы, которые позволяют проводить разделение в тонких пластинах геля, что обеспечивает оптимальное разрешение. Лучшее разрешение на пластинах обусловлено тем, что возникающее во время электрофореза тепло здесь легко рассеивается, а также тем, что гель после электрофореза можно быстро фиксировать. Последнее важно для того, чтобы свести к минимуму диффузию белка в полосах. Пластины позволяют одновременно сравнивать много проб, и их легко сохранять после высушивания на листах фильтровальной бумаги. Радиоактивность в пробах выявляют радиоавтографией и фото-флюорографией, а высушенные на фильтровальной бумаге гели можно легко нарезать ножницами или резаком и после повторного насыщения водой вырезанных сухих полосок просчитывать на сцинтилляционном счетчике. Если не требуется большая разгонка в геле, электрофорез, фиксацию, окраску и высушивание успевают проводить за один день.

Для гель-электрофореза в присутствии ДСН имеется большой набор буферных систем. Лучшее разрешение дают концентрированные буферные системы, у которых верхний (электродный) буфер содержит ионы, обладающие большой подвижностью и движущиеся через гель в виде передней зоны, или фронта. К моменту вхождения в разделяющий гель белки сжимаются этим движущимся фронтом в узкую полосу, а войдя в него, задерживаются за счет того, что гель обладает свойствами «сита». Описанная ниже система представляет собой модификацию концентрирующей буферной системы, предложенной Лэмли [5]. См. также разд. 26,5.L

Разделяющий, или разгоняющий, гель содержит 11,5% акриламида, 0,2% бисакриламида и 0,1% ДСН в 0,375 М трис-буфере, доведенном НС1 до рН 8.8. Полимеризация инициируется удалением воздуха из раствора и добавлением тетраметилэтилендиамина (до 0,8%) и персульфата аммония (до 0,015%). Пока не произойдет полимеризация, разделяющий гель держат под слоем воды. Воду выливают и наслаивают концентрирующий гель, или гель для нанесения, содержащий 4,5% акрил-амида, 0,12% бисакриламида и 0,1% ДСН в 0,125 М трис-буфере, доведенном НС1 до рН 6,8. Этот гель по-лимеризуется добавлением тетраметилэтилендиамина (до 0,125%) и персульфата аммония (до 0,05%). Перед полимеризацией, чтобы сформировать лунки для проб, в концентрирующий гель вставляют тефлоновую (фторопластовую) гребенку.