ше концентрации иода, т. е. 0,75 н.

6.6. АНАЭРОБИОЗ

Иногда трудно провести четкую границу между аэробными и анаэробными условиями. Существуют бактерии, растущие как в присутствии кислорода, так и в его отсутствие (факультативные формы) или предпочитающие среды с низким напряжением кислорода (микро-аэрофилы). Spirillum volutans являются облигатными микроаэрофилами, поскольку для инициации роста они требуют присутствия кислорода в низких концентрациях (~от 3 до 9% О2). Методы культивирования микроаэ-рофильных бактерий приведены в разд. 9.3.1.

Хотя облигатными анаэробами обычно считают бактерии, рост которых невозможен в присутствии растворенного кислорода, на практике к анаэробным относят те бактерии, которые не растут на поверхности (или около нее) твердой или полужидкой среды на воздухе при атмосферном давлении. Аэротолерантные анаэробные бактерии хорошо растут на поверхности агара в чашках при низком, но ощутимом уровне кислорода в атмосфере [24], тогда как более строгие анаэробные бактерии почти немедленно гибнут в такой атмосфере. При удалении кислорода предварительным кипячением среды или его замещении инертным газом условия, необходимые для роста строгих анаэробов, не достигаются.

Окислительно-восстановительный (или редокс) потенциал (Eh) позволяет наиболее удобно измерять степень анаэробиоза [6]. Иными словами, Eh — это мера способности раствора отдавать или принимать электроны, т. е. окисляться или восстанавливаться. Eh выражают в единицах разности электрического потенциала, т. е. в вольтах: чем более положительна эта величина, тем выше концентрация окислителя по отношению к восстановителю в растворе, и наоборот. Способность среды противодействовать изменениям Eh аналогична буферным свойствам растворов.

Обычно в средах, используемых в лаборатории, за увеличение Eh в основном ответствен кислород; при высоких положительных значениях Eh, обусловленных присутствием растворенного кислорода, подавляется рост всех анаэробных бактерий. В то же время положительные значения Eh, обусловленные присутствием в среде других веществ, могут не препятствовать росту даже строгих анаэробов [30, 36]. Устойчивость к Eh разных анаэробных бактерий различна. Однако в стандартной среде рост большинства анаэробных бактерий подавляется при величинах Eh выше —100 мВ. Некоторые из них не растут при потенциале выше —330 мВ; теоретическая концентрация кислорода при этом значении Eh составляет 1,48-10~56 молекул на 1 л *[6]. Даже при потенциале —140 мВ концентрация кислорода составляет только 1,5-1011 молекул на 1 л [10], т. е. менее 1 молекулы кислорода на клетку для многих бактериальных культур. Это показывает, что для выращивания строгих анаэробов важно создание более восстановительных условий, чем те, которые обеспечиваются простым удалением кислорода из культуральной среды.

6.6.1. Измерение Eh

Eh раствора наиболее точно можно измерить электрометрически. Подробно способы измерения и необходимые при этом предосторожности описаны в обзоре Джекоба \[7]. Рассмотренные в нем методики приемлемы для бактериологов общего профиля.

Чтобы найти Eh сред и культур, особенно для анаэробных бактерий, широко используют окислительно-восстановительные красители. Эти красители обратимо окисляются и восстанавливаются, причем в окисленном состоянии они окрашены, а в восстановленном — бесцветны. Разные красители восстанавливаются при различных значениях Eh. Величина Eh, при которой краситель окислен или восстановлен на 50% при рН 7,0, называется стандартным окислительно-восстановительным потенциалом (Ео')Многие анаэробные бактерии могут быстро снижать Eh среды; их способность к росту в среде зависит от физиологического состояния и количества инокулята. Задержка роста после инокуляции наблюдается до тех пор, пока клетки не снизят потенциал до уровня, при котором они могут расти. За снижением потенциала лучше всего следить, включив в среду нетоксичный индикатор Eh. Для этой цели широко используется ресазу-рин в концентрации от 0,1 до 0,2 мг на 100 мл. Индикатор вначале подвергается необратимому восстановлению в резоруфин, который окрашивается в розовый цвет при нейтральных значениях рН. Е0' резоруфина равен —51 мВ при рН 7,0; при Eh около —110 мВ резоруфин обесцвечивается [7].

Когда необходимы очень строгие анаэробные условия, в среду можно добавить феносафранин (Е0' = = 252 мВ) после предварительной проверки его токсичности. Цитрат титана(III) является как восстановителем (Е0'——450 мВ), так и индикатором Eh [37]. При полном окислении он обесцвечивается. Его использование будет описано ниже вместе с другими восстанавливающими агентами.

6.6.2. Восстанавливающие агенты

Восстанавливающие агенты добавляют в большинство сред, предназначенных для культивирования анаэробов, чтобы снизить окислительно-восстановительный потенциал и сбалансировать его на оптимальном уровне. Помимо того что эти вещества должны быть нетоксичными в используемых концентрациях, они должны приводить к такому снижению потенциала, которое было бы приемлемым для исследуемых организмов. Восстанавливающие агенты, особенно широко используемые при культивировании анаэробов, перечислены в табл. 6.6. Все приведенные в ней соединения имеют Е0' достаточно низкий, чтобы полностью восстановить ресазурин, однако для выращивания строгих анаэробов следует использовать только те агенты, для которых Е0'< < —300 мВ.

Восстанавливающий агент сохраняет максимальную эффективность, если основной раствор, лишенный кис

лорода, стерилизуют и хранят в атмосфере инертного газа (методы приготовления восстановленных сред приведены ниже). К среде восстанавливающий агент добавляют в необходимой концентрации непосредственно перед опытом.

Для снижения Eh среды при последующем культивировании анаэробных бактерий можно использовать также факультативно-аэробные бактерии. Так, выращивание в среде клеток Е. coll перед инокуляцией анаэроба приводит к удалению всего остаточного кислорода и снижению Eh до уровня, который наблюдается в условиях полной защиты культуры от кислорода. Перед инокуляцией анаэроба клетки Е. coli можно убить нагреванием. Это необходимо для того, чтобы была уверенность, что используемые факультативные микроорганизмы не влияют на рост анаэробов ни в результате конкуренции за питательные вещества, ни путем выделения токсичных продуктов.

6.6.3. Методы культивирования нестрогих анаэробов

Методы приготовления сред для культивирования и пересева нестрогих анаэробных бактерий, включая большинство клостридиев, довольно просты [13]. Все операции можно проводить в обычной атмосфере при условии соблюдения некоторых предосторожностей для того, чтобы избежать длительного контакта бактерий и среды с кислородом. Для выращивания нестрогих анаэробов существуют следующие приемы.

1. Среду готовят в сосудах, где отношение поверхности среды к ее объему достаточно мало.

2. Для длительной инкубации анаэробов, не образующих газы, например фотосинтезирующих бактерий, наиболее подходящими являются бутыли и сосуды, доверху заполненные свежепрокипяченной средой и закрытые завинчивающимися крышками.

3. Готовят полужидкую среду, добавляя к жидкой среде 0,05—0,1% агара. Полужидкая среда способствует уменьшению конвекционных потоков.

4. На поверхность инокулированной среды наслаивают толстый слой васпара (50% вазелина — 50% парафина).

5. Среду автоклавируют сразу же после смешивания компонентов с восстанавливающим агентом.

6. Среды долго не хранят. Их нельзя хранить в холодильнике, поскольку по мере понижения температуры растворимость кислорода растет.

7. Для контроля за степенью окисленности среды к ней добавляют ресазурин (0,1 мг на 100 мл). Если верхняя треть среды окрашивается непосредственно перед употреблением, ее кипятят и охлаждают перед инокуляцией.

8. Используют по возможности большие объемы ино-кулята.

9. Культуры разводят в пробирках с ростовой средой или в свежеавтоклавированном растворе, содержащем восстанавливающий агент.

10. Некоторые аэротолерантные анаэробы (например, Clostridium perfringens) можно развести в чашке

Петри, нанести на поверхность свежей агаровой среды,

содержащей восстанавливающий агент, и поместить

чашку в камеру, лишенную кислорода. Однако клетки

ряда других анаэробов чувствительны даже к кратковременному контакту с воздухом.

11. Чашки Петри со свежеприготовленными средами, инокулированными аэротолерантными анаэробами или спорами анаэробов, инкубируют в анаэробных условиях. Для этого можно использовать одну из следующих систем.

Вакуумный эксикатор. Его используют только для аэротолерантных анаэробов. Трижды откачивают воздух, пока давление не упадет до 500 мм рт. ст., и заполняют эксикатор инертным газом, например азотом, водородом или их смесью с примесью 5—10% С02 (некоторые анаэробы нуждаются в С02).

Сосуды для анаэробов (анаэростаты) с катализатором. Наиболее часто используют сосуд системы Torbal, модель А-3 (The Torsion Balance Со, Clayton, N. J.). Из него откачивают воздух, как описано выше, и трижды заполняют водородом или газовой смесью с большим содержанием водорода. Чтобы проверить, активен ли катализатор, его подставляют под струю Н2: активный катализатор сильно разогревается уже через 1 мин. Реактивируют катализатор нагреванием до 160 °С в течение 1 ч.

Пакеты или сосуды с генераторами Я2 +С02. Наиболее часто используют систему Gas Рак (BBL Microbiology Systems, Cockeysvil'le, Md.), не требующую откачки воздуха. После активации газогенераторного элемента водой пакет быстро закрывают и следят в течение 30 мин за конденсацией воды, В прозрачные пакеты или сосуды можно поместить полоски индикатора (метиленовый синий) и наблюдать за их обесцвечиванием. Катализатор проверяют и реактивируют, как описано выше.

6.6.4. Метод Хангейта культивирования строгих анаэробов

Многие анаэробы, находящиеся в кишечнике, рубце или в других природных анаэробных условиях, растут только при очень низком окислительно-восстановительном потенциале. Поэтому необходимо защищать среды и клетки даже от кратковременного контакта с кислородом