Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

рно становятся лизогенными.

Метод общей трансдукции

Когда используют нелизогенный реципиент, множественность заражения обычно составляет 1 или немного меньше; при этом клетки, зараженные частицами трансдуцирующего фага Р1, уже не заражаются другими частицами того же фага и поэтому не теряются вследствие лизиса. Поскольку адсорбция фага Р1 протекает не очень быстро (при 37 °С за 20—30 мин, прошедшие после введения, к клеткам прикрепляется только 30—50% фага), исходное количество фаговых частиц берут из расчета 2—3 на одну бактерию; тогда множественность эффективного заражения будет равна 1. В случае использования лизогенного реципиента при повторном заражении клеток фагом выход трансдуктантов не снижается, так как лизогенные клетки иммунны к суперинфицированию фагом PI L4. Чтобы убедиться в этом, можно добавить Р1 Ь4-лизат родителя-донора к нелизо-генному и лизогенному штаммам из расчета 0,5, 2,5 и 12,5 фаговых частиц на одну бактерию. Последней, наибольшей, множественности заражения достичь довольно трудно, если лизат имеет титр 1010 ПОЕ/мл. Трансдук-цию в этих случаях осуществляют следующим образом.

1. Выращивают лизогенный и нелизогенный по фагу PI kc реципиентные штаммы lacZ+ proC до плотности 2-Ю8 клетка/мл, как описано выше в «Определении титра фага» (разд. 14.2.2).

2. Пока выращивают реципиентные штаммы, некоторое количество Р1 Ь4-лизата донора lacZ ргоС+ аэрируют при 37 °С для удаления остатков СНС13. В это же время рассчитывают объем разведенного или неразве-денного лизата (обычно 0,1—0,5 мл), который при добавлении к отобранному объему реципиентных клеток с концентрацией ~2-108 клетка/мл (обычно 0,5—1,9 мл) дает 12,5 ПОЕ на одну бактерию. Затем разводят лизат PI L4 в L-бульоне, содержащем 2,5 мМ СаС12, так чтобы при добавлении фиксированного объема лизата к фиксированному объему реципиентных клеток на одну бактерию приходилось 0,5, 2,5 и 12,5 ПОЕ.

3. Вычисленные объемы бактериальной культуры каждого из реципиентных штаммов вносят в четыре пробирки диаметром 13 и высотой 100 мм и ставят все восемь культур инкубироваться при 37 °С. Определяют титры реципиентных культур посевом соответствующих разведений на L-arap или агар Penassay.

4. Добавляют вычисленный объем донорского лизата PI L4 к трем из четырех культур каждого реципиентного штамма и равный объем L-бульона+ 2,5 мМ СаСЬ к четвертой культуре, которая служит контролем. Инфицировать культуры лучше всего с 3-мин интервалом,

5. После предварительной адсорбции фага в течение 30 мин ко всем пробам, содержащим смесь фаговых частиц бактерий, добавляют 100 мкл 0,2 М лимоннокислого натрия для хелатирования ионов Са2+ и остановки дальнейшего инфицирования фагом Р1.

6. Вносят аликвоты неразведенных и разведенных в 10 раз проб каждой инфицированной и неинфицирован-ной культуры (100 мкл) в чашки с минимальным агаром VB, содержащим лактозу, соли янтарной кислоты и три-фенилтетразолийхлорид. Чашки инкубируют 2 сут при 37 °С и затем подсчитывают колонии.

7. Для определения титра выживших клеток делают посев соответствующих разведений зараженных и неза-раженных культур на L-arap или агар Penassay. Чашки инкубируют при 37 °С в течение ночи.

8. Вновь определяют титр PI L4^H3aTa методом, описанным выше в «Определении титра фага». Это особенно важно при работе с вновь приготовленными лиза-тами Р1, так как иногда в течение первой недели титр возрастает в 2—3 раза в результате вызванной хлороформом дезагрегации фаговых частиц, слипающихся из-за присутствия обрывков бактериальных клеток и (или) мельчайших кусочков агара.

9. Чтобы убедиться в отсутствии жизнеспособных клеток донора в лизате PI L4, делают посев 100 мкл последнего на селективный минимальный агар VB.

Когда используют лизогенный по фагу PI kc реци-пиентный штамм, число трансдуктантов пропорционально титру взятого фага, в то время как в случае нелизо-генного реципиента число трансдуктантов должно быть меньше при множественности заражения большей единицы, чем при множественности заражения, меньшей или равной единице. В обоих случаях частота котранс-дукции lacZ и ргоС+ должна быть одной и той же в пределах ошибки измерений. Если использовать распределение Пуассона по частоте гибели клеток нелизоген-ного реципиента для каждого инфицирования, то можно определить фактическую множественность заражения

[4].

Применение

Общая трансдукция сыграла большую роль в определении точного расположения генов в бактериальной хромосоме. С этой целью были использованы штаммы, имеющие помимо маркера, по которому вели отбор, два или три других наследуемых аллеля. С подобными штаммами осуществляли трансдукцию со всеми возможными взаимными комбинациями отбираемого и неотби-раемых маркеров. Для создания штаммов с желаемым генотипом использовали также трансдукцию, опосредуемую фагом Р1. Мутантный аллель с известными свойствами можно котрансдуцировать в какой-либо штамм, ведя отбор по наследованию прилежащего маркера дикого типа. Если котрансдукция невозможна, то мутант-ные аллели можно ввести трансдукцией фагом Р1 и — после сегрегации и фенотипической экспрессии — накопить соответствующие клетки ампициллин-циклосерино-вым обогащением. Более новым и более изящным является метод, основанный на переносе факторов устойчивости к лекарственным препаратам (ФУЛП) [7]; в этом случае способ отбора клеток, как имеющих, так и не имеющих индуцированные мутации, основан на инактивации генов за счет вставки при переносе ФУЛП. С помощью модификации этой методики можно располагать способные к переносу ФУЛП в локусах, прилежащих к аллелю дикого типа или мутировавшему алле-лю данного гена, и передавать этот аллель от одного штамма другому.

Еще один полезный метод, разработанный Хонгом и Эймсом [20], позволяет индуцировать мутации в неизвестных генах, тесно сцепленных с известными. Обработкой трансдуцирующего фаголизата азотистой кислотой, гидроксиламином или нитрозогуанидином с последующим отбором при 30 °С трансдуктантов, в которых наследуется известный аллель дикого типа, можно с высокой частотой получать мутации в генах, определяющих температурочувствительные дефекты в некоторых жизненно важных функциях, причем за эти функции ответственны гены, соседние с аллелем, по которому ведется отбор.

С помощью трансдукции, опосредованной фагом Р1, можно также определить, является тот или иной признак хромосомным или плазмидным по своему происхождению. Р1-Фаголизат, полученный из донорных клеток, облучают возрастающими дозами ультрафиолета, и облученные и необлученные лизаты используют для трансдукции реципиентному штамму, который затем подвергают отбору на интересующий наследуемый признак донора. Если признак детерминируется хромосомным геном, то малые дозы ультрафиолета будут увеличивать общее число трансдуктантов, так как ультрафиолет повышает частоту рекомбинации; если же признак детерминируется плазмидой, то частота трансдуктантов, наследующих донорский признак, с увеличением дозы ультрафиолета будет уменьшаться, поскольку вызываемые облучением повреждения препятствуют репликации плазмиды после ее переноса в реципиентные клетки путем трансдукции.

Наличие производных фага Р1, обладающих способностью переносить ФУЛП, позволяет производить позитивный отбор лизогенных бактерий, присутствующих в относительно малых количествах, и находить новые Р1-трансдуцирующие системы среди других представителей энтеробактерий (Enterobacteriaceae) [17]. Можно также отобрать редко встречающиеся производные фага Р1 с более выраженной способностью размножаться в клетках данного штамма или мутанты хозяина, в которых фаг Р1 размножается лучше, чем на других.

Фаги, осуществляющие общую трансдукцию, известны для множества родов бактерий. Лучше всего изучена система, в которой используются фаг Р22 и бактерия S. typhimurium [39]. У нее есть определенные преимущества по сравнению с системой PI—Е. coll, заключающиеся в том, что фаг Р22 легко поддается размножению в жидких лизатах, образует большие стерильные пятна и дает лизаты, остающиеся стабильными годами. Важно также, что эта система позволяет анализировать мутантные аллели на способность дополнять друг друга за счет процесса, называемого абортивной трансдукцией [18, 33].

14.3. КОНЪЮГАЦИЯ

Конъюгация—это тип опосредуемого клеткой переноса генов, который требует наличия у клетки-донора конъюгативной плазмиды. Эта плазмида может реплицироваться или в цитоплазме синхронно с бактериальной хромосомой, или как часть хромосомы в интегрированном с ней состоянии. Конъюгативные плазмиды обладают генами tra, которые определяют и (или) контролируют: 1) образование отростков, называемых донорскими половыми ворсинками, которые обязательны (по крайней мере для большинства конъюгативных плазмид) для осуществления донорными клетками контакта с клетками реципиента; 2) вещества, снижающие частоту конъюгации (спаривания) донора с донором, и 3) конъюгационный перенос плазмидной или хромосомной ДНК, начинающийся с определенного места (точка начала переноса) в молекуле конъюгативной плазмиды. Конъюгативные плазмиды имеют также гены, контролирующие 1) их репликацию, не связанную с половым процессом, 2) число копий плазмид в пересчете на эквивалент хромосомной ДНК и 3) функции несовместимости. В конъюгативных плазмидах могут также находиться гены, отвечающие за другие фенотипические признаки, такие, как устойчивость к антибиотикам, устойчивость к ионам тяжелых металлов, продукция бактериоцинов, поверхностных антигенов и энтеротоксинов. Конъюгативные плазмиды имеются, по-видимому, у всех грамотри-цательных бактерий; не так давно они были обнаружены у некоторых видов Streptomyces и Streptococcus.

Из конъюгативных плазмид лучше всех изучен половой фактор F (фактор фертильности) бактерии Е. coli К-12. Эта плазмида может существовать как автономно в цитоплазме у Р+-донора, так и в интегрированном состоянии у Hfr-донора. Реципиентные штаммы не имеют фактора F и обозначаются F~~. F+'Доноры передают F-плазмиды практически всем Р~-клеткам, с которыми они спариваются, но генетическую информацию хромосом они

страница 17
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.09.2019)