Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

способны передавать лишь с низкой частотой. Все хромосомные маркеры донора F4* передаются с примерно одинаковой частотой (около Ю-5 на одну донор-ную клетку для любого маркера), и большинство образовавшихся трансконъюгантов наследует фактор F. Доноры Hfr передают хромосому направленно и последовательно начиная с генетически фиксированной точки, зависящей от места интеграции фактора F в бактериальной хромосоме. С самыми высокими частотами передаются те генетические маркеры, которые находятся вблизи точки начала переноса Hfr-хромосомы; по мере удаления маркеров от этой точки частота их переноса и наследования пропорционально уменьшается. Такая картина наблюдается вследствие спонтанного случайного прекращения передачи хромосомы. За исключением редких случаев достаточно длительной конъюгации, когда возможен перенос всей Hfr-хромосомы, большинство трансконъюгантов, унаследовавших хромосомный материал Hfr, сохраняет генотип F~ так как части интегрированной F-плазмиды передаются последними в качестве замыкающих маркеров.

Скорость передачи Hfr-хромосомы постоянна при 37 °С. Используя клетки штамма F~ в большой концентрации и прерывая конъюгацию на последовательных этапах, можно определить время, необходимое для переноса любого маркера, и интервал времени, проходящий между переносом последовательно передающихся маркеров. Проводя опыты по конъюгации с Hfr-клетками при 37 °С, удалось определить, что перенос всей хромосомы Е. coll занимает 100 мин; при этом скорость передачи ДНК составляет ~ 26 * 106 дал/мин. F-Плазмида в данном случае, подобно другим конъюгативным плазми-дам, содержит так называемые IS-последовательности (от англ. insertion sequences), которые присутствуют и в хромосоме Е. coli. Именно взаимное узнавание этих последовательностей с последующей рекомбинацией позволяет фактору F определенным образом встраиваться в хромосому Е. coli [7]. Генетическими методами было идентифицировано около 25—30 мест интеграции фактора F, что привело к созданию Hfr-доноров с разным началом и направлением переноса хромосомы [13, 27].

Более полное обсуждение процесса и механизма конъюгации можно найти в различных обзорах [3, 11, 12, 38], а также в учебниках и монографиях [16, 18, 21, 25]. С методами осуществления конъюгационных скрещиваний, помимо приведенных ниже, можно ознакомиться в руководствах Клоуса и Хэйеса [1] и Миллера [2].

Общие методы

Поскольку цель экспериментов по конъюгации заключается в выделении трансконъюгантов, обладающих признаками как донора, так и реципиента, следует использовать штаммы с генетическими маркерами, легко поддающимися отбору. В экспериментах по изучению кинетики конъюгационного переноса важно уметь останавливать процесс конъюгации через точные интервалы времени и предотвращать дальнейшее его течение на селективной среде; эта проблема возникает при высеве клеток донора и реципиента с высокой плотностью. Простейший способ достичь этой цели — использовать реци-пиентный штамм, устойчивый к налидиксовой кислоте благодаря мутации в гене nalA. Налидиксовая кислота ингибирует конъюгационный перенос ДНК, и при ее добавлении к смеси конъюгирующих бактерий, состоящей из чувствительного к этой кислоте донора и устойчивого реципиента, перенос как плазмидной, так и хромосомной ДНК немедленно останавливается. Для этого же были использованы реципиентные клетки, устойчивые к рифампицину вследствие мутации в гене гроВ, но рифам-пицин не вызывает мгновенной остановки конъюгационного переноса ДНК- Он останавливает транскрипцию генетической информации донора, что крайне полезно при попытке выявить происходящий с низкой частотой перенос плазмиды, определяющей устойчивость к лекарственным препаратам, таким, как ампициллин, так как продолжающийся в доноре синтез fj-лактамазы приводит к инактивации включенного в среду ампициллина и препятствует выявлению трансконъюгантов типа Арг.

Большинство конъюгативных плазмид природных штаммов бактерий репрессированы в отношении экспрессии донорного фенотипа, так что лишь одна из 1000—10 000 клеток, имеющих такую плазмиду, способна в оптимальных условиях передавать ее. Но, поскольку при передаче в реципиентную клетку в некоторых случаях происходит временная дерепрессия, для выявления переноса конъюгативной плазмиды иногда требуется проводить спаривание в течение нескольких часов или больше и периодически делать разведения смеси конъ-югирующих бактерий для поддержания соответствующих плотностей. Выделены мутанты, у которых конъюгативные плазмиды дерепрессированы; генетическими донорами практически могут быть все донорные клетки таких мутантов, содержащих конъюгативную плазмиду. F-Плазмида — одна из наиболее охарактеризованных дерепрессированных конъюгативных плазмид.

Хотя некоторые плазмиды стимулируют конъюгаци-онный перенос ДНК в условиях контакта клеток в жидкой среде, другие более эффективны в этом отношении при спаривании клеток донора и реципиента на агаре или на мембранном фильтре, лежащем на питательной агаровой среде. В последнем случае на питательный агар обычно наслаивают питательный мягкий агар и чашки инкубируют в неперевернутом виде нужный период времени, после чего фильтр перекладывают на чашку с селективным агаром, на котором не способны расти клетки-доноры. Можно поступить иначе: погрузить фильтр в солевой буфер и удалить с него клетки периодическим встряхиванием в смесителе типа Vortex, после чего засеять соответствующие разведения на селективную агаровую среду.

Другая варьируемая величина, за которой необходимо следить при определении оптимальных условий конъ-югационного переноса, — это температура. Многие конъюгативные плазмиды энтеробактерий переносятся с наибольшей частотой, когда спаривание проводят при температуре 37°С или близкой к ней, Для некоторых из них перенос идет при 25 °С, но его трудно выявить, и, если оставить культуры донора перед смешиванием с клетками реципиента на некоторое время при комнатной температуре, это может привести к значительному снижению частоты переноса, происходящего при 37 °С. Вместе с тем существуют конъюгативные плазмиды, например в группе ГпсН, для переноса которых оптимальна температура 25 °С, и они хуже переносятся при 37 °С, Анализируя возможность передачи признака конъюгативной плазмидой, целесообразно сопоставить течение процесса при 37 и 25 °С.

Рестрикция—это процесс деградации чужеродной ДНК в том случае, когда микроорганизм распознает поступающую в него ДНК как отличную от своей. Иногда рестрикцией объясняется невозможность обнаружения переноса конъюгативных плазмид при внутривидовых, межвидовых и межродовых скрещиваниях. Мутанты, лишенные систем рестрикции (hsdR или hsdS), имеются у Е. coli К-12, 5. typhimurium LT2 и других хорошо охарактеризованных и часто используемых видов бактерий. Даже в отсутствие реципиента, неспособного осуществлять рестрикцию, эта потенциально существующая проблема часто может быть решена прогреванием клеток реципиента перед конъюгацией в течение 5—10 мин при 50 °С или 15—20 мин при 45 °С. Действительно, я наблюдал, что при выращивании в течение 5—7 генераций перед конъюгацией при 42 °С многих реципиентных штаммов Е. coli более 95% из них становились способными к восприятию конъюгативных плазмид.

14.3Л. Перенос конъюгативных плазмид (F'- или R-плазмид в Е. coli F~)

Бактериальные штаммы

Изучение переноса конъюгативных плазмид облегчается, если плазмида определяет признак, по которому легко вести отбор. Р'-Плазмиды (имеющиеся у Hfr-доно-ров) несут помимо фактора F последовательности хромосомной ДНК, которые примыкали к фактору F, когда он был интегрирован в хромосому. Например, донорные клетки штамма 9 (табл. 14.1), имеющие плазмиду F'/ac+, могут легко передавать признак 1ас+ клеткам штамма F~, например штамма 10 (табл. 14.1), причем образующиеся трансконъюганты легко отобрать.

Нет трудностей и при изучении переноса R-плазмид. Легко выявляется перенос дерепрессированных производных R-плазмид, таких, как плазмида R100 drd-1 штамма 11 (табл. 14.1), поскольку эта плазмида обусловливает устойчивость к тетрациклину (Тсг) в концентрации 25—50 мкг/мл, хлорамфениколу (Стг) в концентрации 50 мкг/мл, стрептомицину (Smr) в концентрации 50 мкг/мл и сульфаниламиду (Snr) в концентрации 25— 40 мкг/мл (на синтетической среде). Донор, имеющий плазмиду R100 drd-1, должен быть чувствительным к налидиксовой кислоте, а реципиент, такой, как штамм 10 (табл. 14.1), не должен обладать устойчивостью ни к одному из антибиотиков, устойчивость к которым придает R100 drd-1, и должен иметь мутацию nalA.

Среды

Оптимальный рост и максимальную экспрессию фенотипов донора и реципиента обеспечивают и L-бульон, и бульон Penassay. Для титрования культур донора и реципиента можно использовать агар Penassay (с 8 г NaCl в 1 л). Если к нему добавить Тс, Cm или Sm и Nal (разд. 14.4, табл. 14.4), то он годится для отбора трансконъюгантов, содержащих R-плазмиды. Для отбора трансконъюгантов типа Lac+Nalr можно применять агар, приготовленный на среде VB-E и дополненный 0,5% лактозы, пролином и налидиксовой кислотой в концентрации 50 мкг/мл. Методы приготовления сред см. в разд. 14.4.

Метод переноса плазмид Р

1. В пробирки диаметром 16 и высотой 125 (или 150) мм, содержащие по 5 мл бульона Penassay, вносят полные петли выращенной на скошенном агаре биомассы каждого типа клеток и инкубируют в течение ночи при 37 °С без аэрации.

2. Разводят выросшие культуры 1 : 100 или 1 :200 в 10 и 20 мл предварительно подогретого бульона Penassay. Культуры аэрируют либо пропусканием пузырьков воздуха, либо встряхиванием и выращивают до концентрации ~ 2 • 108 клетка/мл. Для оптимальной экспрессии фенотипа донора за 30 мин до начала конъюгации аэрацию лучше прекратить, так как рост без аэрации благоприятствует образованию максимального числа и максимальной длины половых ворсинок, детерминируемых фактором F. Правда, это может относиться не ко всем типам конъюгативных плазмид.

3. В водяную баню с температурой 37 °С помещают либо плоскодонные микроколбы Фернбаха на 125 мл, либо 250-мл колбы Эрленмейера, снаб

страница 18
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.09.2019)