Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

женные утяжеляющими свинцовыми кольцами вокруг горлышка, так чтобы уровень воды в бане был немного ниже пробок колб. Свинцовые кольца можно вырезать в форме пончиков из свинцового листа толщиной б—8 мм. Если нет свинцовых колец, закрепляют колбы таким образом, чтобы они не всплывали и были бы погружены в воду. Погружение колб важно в том случае, когда температура культуры во время конъюгации должна поддерживаться на уровне 37 °С.

4. В колбу наливают 9 мл культуры реципиента, чтобы она приняла температуру бани, и определяют ее титр посевом разведения 10~6, равномерно распределяя его по поверхности агара Penassay в чашках. Делают также посев аликвот неразведенной реципиентной культуры объемом 100 мкл на селективную агаровую среду, чтобы убедиться в том, что культура свободна от постороннего материала и содержит небольшое количество ревертантов (или их совсем нет).

5. Через 5 мин добавляют в колбу 1 мл культуры донора и легким вращательным движением смешивают клетки донора и реципиента. Титруют культуру донора и высевают 100 мкл ее на селективную среду. Обращают внимание на то, чтобы общий объем находящейся в колбе жидкости, равный 10 мл, имел высоту слоя 2 мм — это обеспечивает достаточную диффузию кислорода к конъюгирующим клеткам и устраняет необходимость аэрации встряхиванием. Хотя обычно в подобных опытах используют избыток реципиентных клеток, можно брать достаточно широкий интервал отношений клеток донора и реципиента — от 1 :20 до 1:1; требуемые отношения получают варьированием объема и (или) плотностей добавляемых в колбу культур донора и реципиента.

6. Через 5-, 10- или 15-мин интервалы в течение 1 ч смесь донорных и реципиентных клеток разводят и высевают аликвоты объемом 100 мкл (50 мкл на чашку) на селективную агаровую среду. При длительности конъюгации до 30 мин делают конечные разведения 10~2—10~3, при более продолжительной конъюгации — разведения 10~3—10~4. Чашки переворачивают и инкубируют при 37 °С.

Культуры донора- и реципиента, выращенные на комплексных богатых средах, образуют трансконъюган-ты с большей частотой, чем выращенные на синтетических средах. Однако селекция на синтетических средах трансконъюгантов, которые являются потомками клеток, выращенных и конъюгировавших в бульоне, вследствие худших условий роста приводит к выявлению меньшего числа трансконъюгантов по сравнению с реально образовавшимся. Эту трудность можно преодолеть добавлением 10%-ного (объем/объем) бульона Penassay к среде СБЖ, используемой для разведения смесей конъюги-рующих бактерий, так как при добавлении к селективной минимальной агаровой среде небольшого количества бульона способны образовывать колонии все транс-конъюганты типа Lac+Nalr.

Частоту образования трансконъюгантов для каждого времени прерывания процесса конъюгации вычисляют делением титра трансконъюгантов в 1 мл смеси на титр донорных клеток в смеси в начале процесса.

Метод переноса R-плазмид

Этапы с 1-го по 5-й те же, что описаны выше для переноса F'-плазмид. Если б-й этап проводить, как описано выше, то трансконъюганты типов TcrNalr и CmrNalr будут выявляться с большей частотой, чем трансконъюганты типа SmrNalr, особенно при раннем прерывании процесса, а частоты, определенные для всех типов трансконъюгантов, будут ниже тех, которые реально имеют место. Это вызвано тем, что: 1) для экспрессии устойчивости к препаратам, обусловленной R-плазмида-ми, требуется, чтобы транскрипция и трансляция генов R-плазмид в клетке-реципиенте осуществились до воздействия препаратов; 2) тетрациклин и хлорамфеникол являются бактериостатиками, и поэтому экспрессия устойчивости к этим препаратам может медленно развиваться даже в их присутствии; в то же время стрептомицин бактерициден и вызывает гибель всех трансконъгогантов, которые еще не проявили устойчивости к нему. Эти трудности, касающиеся фенотипической экспрессии, возрастают еще больше при работе с R-плазмидами, переносящими устойчивость к ампициллину или кана-мицину.

Чтобы избежать их и добиться точности в измерении скорости и частоты переноса R-плазмид в каждый из моментов прерывания конъюгации, проводят следующий эксперимент. 100 мкл смеси конъюгирующих клеток и 0,9 мл бульона Penassay, содержащего 50 мкг/мл нали-диксовой кислоты, вносят в пробирки диаметром 13 и высотой 100 мм при 37 °С. Оставляют пробирки на 20— 30 мин при 37 °С, а затем разводят пробы и делают посев на селективные среды.

Чтобы убедиться в том, что гены, ответственные за различные типы устойчивости к лекарственным препаратам, действительно передаются одной и той же плаз-мидой, отбирают около 10 колоний каждого типа трансконъюгантов стерильными зубочистками и высевают их на другие селективные среды.

Применение

Вышеописанные методики могут использоваться для изучения конъюгационного переноса генов, которые ответственны за кодирование множества признаков, определяемых плазмидами. Конечно, выявление переноса плазмид Col [3] и плазмид, обусловливающих такие признаки, как продукция антигенов и энтеротоксинов [16], требует применения специальных методик, так как прямой отбор по этим признакам невозможен. Некоторые конъюгативные плазмиды способны включаться в бактериальную хромосому с образованием доноров типа Hfr и при исключении из хромосомы могут захватывать часть хромосомной генетической информации, превращаясь в плазмиды типов R', СоГ или F'. Такие плазмиды могут использоваться для изучения отношений доминантности— рецессивности, комплементарности между аллелями, а также различных аспектов регуляции генов. Их можно применять и для конструирования штаммов [2]. Эти плазмиды имеют гомологичные с хромосомой участки и их можно применять вместо доноров Hfr для увеличения подвижности и переноса хромосомных генов в определенном направлении и определенной последовательности [18]. Это особенно полезно в связи с тем, что плазмиды R', СоГ и F' способны активировать хромосомы штаммов (или видов) бактерий, для которых не выделены доноры типа Hfr и которые близкородственны к штамму, из которого были получены плазмиды R', СоГ или F'.

14.3.2. Хромосомный перенос

(в Е. coli F~ от Е. coli Hfr)

Штаммы бактерий

У Е. coli выделено множество штаммов типа Hfr с различными точками начала переноса и различными направлениями хромосомного переноса [13, 27]. Выбор штамма Hfr, таким образом, зависит от участка бактериальной хромосомы, который собираются изучать в отношении картирования генетических локусов. Новые Hfr-доноры могут быть легко выделены на различном генетическом фоне с использованием либо модифицированного флуктуационного теста со штаммом F+ [6], либо интегративной супрессии в штамме F+ или R+, имеющем мутацию dnaA(Ts) [30]. Методы осуществления скрещиваний типа HfrXF- можно проиллюстрировать, используя какой-либо Hfr-штамм, например прототрофный штамм 12 (табл. 14.1), который передает свою хромосому O-thr leu proA tac.pyrB F и чувствителен к нали-диксовой кислоте и стрептомицину, и какой-нибудь штамм F", например штамм 14 (табл. 14.1), с мутациями, обусловливающими ауксотрофность по лейцину, пролину, аденину, триптофану и тиамину и устойчивость к налидиксовой кислоте и стрептомицину. У штамма 14 имеются и другие мутации, и наследование их аллелей дикого типа будет происходить как наследование маркеров, по которым не ведется отбор. Штамм 13 (табл. 14.1) несет меньше мутаций, чем штамм 14; он более удобен для проверки стабильности Hfr-фенотипа в штамме 12.

Среды

Как L-бульон, так и бульон Penassay обеспечивают оптимальный рост и максимальную экспрессию донор-ного и реципиентного фенотипов. Для определения титра культур донора и реципиента можно использовать агар Penassay (с добавкой 8 г NaCl на 1 л), а для отбора трансконъюгантов — соответствующим образом дополненную агаровую среду VB-E. Например, трансконъ-юганты типа Leu+Nalr при скрещивании штаммов 12 и 14 можно отобрать на среде, содержащей 0,5% глюкозы, а также пролин, аденин, триптофан, тиамин и налидик-совую кислоту (концентрации добавок см. в табл. 14.4 и 14.5). Для разведения можно брать солевой буфер с желатиной (СБЖ), который дополняют до 10% (объем/объем) бульоном в том случае, когда смесь конъюгирующих клеток, находящуюся в комплексной среде, разводят перед посевом на синтетическую среду. Это небольшое количество бульона обеспечивает питательные вещества для осуществления рекомбинации, равно как и для фенотипической экспрессии признаков донора, и способствует максимальному выходу трансконъюгантов. Методы приготовления сред см. в разд. 14.4.

Проверка стабильности фенотипа Hfr

Поскольку доноры Hfr возникают в результате встраивания конъюгативной плазмиды в бактериальную хромосому, они могут возвращаться к состоянию, при котором эта плазмида вновь оказывается в цитоплазме. Поэтому, перед тем как использовать данный штамм в экспериментах по конъюгации, важно убедиться в том, что большая часть клеток популяции Hfr действительно обладает фенотипом Hfr. Это можно сделать как методом перепечатывания с чашки на чашку (метод отпечатков), так и методом отбора и посева штрихом.

Перепечатывание с чашки на чашку

1. Культуру Hfr разводят так, чтобы при высеве на агар Penassay на одной чашке выросло 100 хорошо отделенных друг от друга колоний. Инкубируют 12—16 ч при 37 °С.

Ill

2. Наносят 50—100 мкл выращенной в бульоне находящейся в логарифмической фазе культуры F~ штамма 13 (табл. 14.1) на поверхность агара, приготовленного на минимальной селективной среде для отбора трансконъюгантов типа Leu+Strr.

3. Перепечатывают колонии Hfr-культуры в чашку с минимальным агаром и нанесенными на него клетками штамма F~. Фиксируют взаимную ориентацию и расположение колоний с помощью специальных пометок на дне исходной чашки и чашки-копии. Чашки инкубируют 24—48 ч при 37 °С.

4. В случае каждой колонии культуры Hfr, сохранившей Hfr-фенотип, должны быть видны сливающиеся пятна роста рекомбинантов; в случае колонии культуры Hfr, претерпевшей обратную мутацию и вернувшейся к состоянию F+, будут видны только 0, 1 или 2 рекомби-нантные колонии.

5. Если в культуре достаточно много р

страница 19
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.11.2019)